CLDN6调控肝癌细胞可塑性的作用机制及靶向CLDN6抗体偶联药物的开发与验证
作者单位：广州医科大学
学位级别：硕士
导师姓名：刘铭
授予年度：2020年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学]
摘 要：背景与目的肝癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,预后差,是世界第三大的恶性肿瘤死亡原因。肝癌发病早期不易被发现,对放化疗不敏感而容易复发转移,临床上治疗首选外科手术治疗,但其5年生存率低,预后差。缺乏合适的早期检测生物标志物和有限的治疗策略是高死亡率的主要原因,目前对肝细胞癌发病机制的研究尚处于初级阶段。由于较高的耐药率和肿瘤复发率,索拉非尼等多激酶抑制剂治疗晚期患者的总体生存获益小于3个月。因此,进一步研究肝癌耐药的分子机制,针对性地开发新的治疗药物迫在眉睫。CLDN6(Claudin-6)是一种完整的细胞膜蛋白,在细胞膜上多次跨膜,是细胞间紧密连接复合体的重要组成部分之一。研究发现,CLDN6在多种上皮性肿瘤中有异常表达,是Claudins家族的重要成员。Claudins属于紧密连接跨膜蛋白家族,在多种生物学过程中起关键作用,其中可能包括肿瘤可塑性和胚胎干细胞多能性。在前期研究中,我们通过分析不同发育阶段的转录组数据,我们发现Claudins家族基因在肝细胞分化过程中的表达模式发生了显著变化,而CLDN6在胚胎干细胞和肝祖细胞中均有高表达,在成熟肝细胞无明显表达;通过生物信息学分析与公共数据库挖掘,我们发现CLDN6在肝细胞癌组织中表达上调,而在其他正常组织中表达低或无表达。上述结果提示CLDN6可能与肝细胞癌的肿瘤谱系可塑性调控密切相关,这使其可能成为肝癌治疗中一个新的分子靶标。在本研究中,考虑到CLDN6独特的表达模式,我们开发了一种与细胞毒性药物DM1偶联的抗CLDN6抗体偶联药物,用于靶向高度可塑性的肝癌肿瘤细胞。本文拟探讨CLDN6在促进肝癌细胞可塑性的作用机制及抗CLDN6抗体偶联药物的开发与验证。方法1、应用RT-qPCR定量核酸扩增检测系统检测CLDN6在肝细胞癌组织及其配对的近端癌旁组织与远端癌旁组织中的m RNA表达;采用免疫组化染色的实验方法检测CLDN6在肝癌组织中的表达。2、通过慢病毒包装体系分别建立了过表达CLDN6与敲低CLDN6的肝癌细胞系,通过检测相应肝癌细胞系的自我更新能力、体内成瘤能力、肝祖细胞标志物与胆管上皮细胞标志物表达的变化观察CLDN6对肝癌细胞系谱系可塑性的影响。3、进行体外药物敏感试验以检测CLDN6与索拉非尼耐药之间的关系;对索拉非尼耐药处理后的肝癌细胞系中耐药相关标志物、肝祖细胞标志物与胆管上皮细胞标志物表达的变化进行检测以研究CLDN6与肝细胞癌索拉非尼耐药及其谱系可塑性的联系。4、通过高通量转录组测序寻找CLDN6的下游靶标及富集通路,并应用免疫荧光、Western Blot和Co-IP等方法研究CLDN6对肝癌细胞系谱系可塑性调控的分子机制。5、开发一种抗CLDN6特异性单克隆抗体与细胞毒性药物DM1偶联后的抗体偶联药物,通过体内外等实验验证靶向肝癌肿瘤细胞可塑性的效果。结果1、CLDN6主要表达在细胞膜上。CLDN6在胚胎干细胞和肝祖细胞中均有高表达,在成熟肝细胞中无明显表达;在肝癌及近端癌旁组织表达上调,远端癌旁正常肝组织无明显表达;在索拉非尼耐药后的肝癌细胞残留组织中表达明显上调。2、在肝癌细胞系中,过表达CLDN6能显著促进肝癌细胞的增殖、克隆形成、自我更新和致瘤性;相反,敲低CLDN6可明显减弱肝癌细胞的上述恶性表型。转录组测序的GSEA分析表明,CLDN6调控的基因与胚胎干细胞和胆管上皮细胞密切相关。在RT-qPCR与Western Blot等实验结果也显示成熟肝细胞标志物(ALB、TTR、APOA1等)与CLDN6的表达呈负相关,胆管上皮细胞标志物(EPCAM、KRT19、SOX9等)与CLDN6的表达呈正相关。3、在肝癌细胞中,CLDN6过表达后可导致索拉非尼耐药能力增强,CLDN6敲低后可导致索拉非尼耐药能力减弱。在索拉非尼耐药后的肝癌细胞中,CLDN6及胆管上皮细胞标志物(EPCAM、KRT19、SOX9等)表达上调。4、在上述转录组测序的GSEA分析中我们也能得出,CLDN6调控的基因与Hippo信号通路息息相关。在肝癌细胞系中,CLDN6过表达后YAP1及其下游激活的基因(CTGF、AREG、ID1等)表达上调;CLDN6敲低后,YAP1及其下游激活的基因表达下调。在CLDN6过表达的肝癌细胞系中,YAP1蛋白具有更好的稳定性,并且入核量增多。Co-IP实验的结果显示CLDN6通过TJP2介导间接促进了YAP1入核,从而进一步激活Hippo信号通路。5、GTEx数据库中CLDN6的表达数据显示,CLDN6在除生殖系统外的人正常组织器官中基本无表达。随后,我们开发出一种针对CLDN6为抗原靶点的抗CLDN6抗体偶联药物,并进行体内外实验验证。流式细胞与体外药物敏感实验显示,CLDN6阳性的Hep G2与抗CLDN6抗体偶联药物有明显的结合,并具有明
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