淫羊藿苷延缓骨髓间充质干细胞衰老的机制研究

作     者：徐家宁 

作者单位：中国人民解放军海军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：唐昊

授予年度：2023年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：衰老 淫羊藿苷 过氧化氢 骨髓间充质干细胞 雌激素 

摘      要：背景骨折是一种临床常见疾病,是指骨的连续性彻底或部分断裂,在各个年龄段都可发生。但随着年龄的增长,骨折发生率增加,骨折愈合所需时间延长,骨折相关并发症增多导致老年骨折患者生活质量的下降。因此如何提升老年骨折病人的骨折愈合速度,减少并发症的发生显得十分重要。骨髓间充质干细胞(BMSCs,Bone marrow stem cells)是非造血基质干细胞,表现出向软骨细胞和成骨细胞的多能分化能力,在骨折愈合中发挥巨大作用。骨科疾病(如骨质疏松症、股骨头坏死、骨缺损和骨不连疾病)的常规治疗由于无法改善骨量损失,临床疗效不佳,目前的重点是使用BMSCs进行组织再生,许多研究已经验证了使用骨髓间充质干细胞治疗促进骨折愈合方法的可行性。随着年龄的增长,骨折愈合的延迟被归因于再生的骨髓间充质干细胞数量减少、功能的衰退,以及指导血管生成的内皮祖细胞性能低下。淫羊藿作为一种传统中药,具备补肾气、抗氧化以及促进骨折愈合的作用。研究表明淫羊藿苷是淫羊藿的主要成分,具有类雌激素样结构,可发挥类雌激素作用,可与体内雌激素受体结合发挥相应作用,可促进骨形成,抑制骨吸收。目前关于淫羊藿苷与BMSCs之间的研究很多,二者存在密切联系,但关于其与衰老骨髓间充质干细胞的研究较少。研究表明,衰老骨髓间充质干细胞的形态、功能以及各项衰老指标会发生改变,本实验研究淫羊藿苷对于衰老骨髓间充质干细胞的衰老指标影响以及可能的作用机制。目的BMSCs与骨折愈合联系密切,在骨折愈合中发挥了巨大作用。但BMSCs的数量、增殖、迁移能力和分化潜能方面会随年龄增长而发生不利改变,导致老年人骨折愈合功能受损。关于如何利用BMSCs促进骨折愈合,目前研究较火热的是进行骨髓间充质干细胞移植来促进愈合,但移植存在血栓形成以及免疫排斥等不良反应,存在一定局限性。结合BMSCs随着年龄发生的不利改变,通过延缓或改善自身骨髓间充质干细胞衰老,维持其细胞活性与功能是一种很好的研究思路。研究发现,雌激素具有延缓衰老、抗氧化作用、促成骨、抑制破骨等作用,因此利用雌激素治疗是比较理想的选择。但雌激素不仅仅作用于骨髓间充质干细胞,也会在其他系统、其他细胞之间发挥作用,影响自身雌激素代谢异常或在体内产生不良效应。淫羊藿苷(ICA,Icariin)具有类雌激素样结构,可发挥雌激素样作用,且本身不是雌激素,不影响本身雌激素分泌。因此,选取淫羊藿苷作为本实验的主体,探讨其能否影响衰老BMSCs,及其可能的作用机制及疗效是本研究的主要内容。本实验采用16月龄的衰老C57/BL小鼠以及8周龄的年轻C57/BL小鼠,进行影像学检测发现16月龄的衰老小鼠骨密度下降,骨折愈合相对缓慢;并且研究二者骨髓间充质干细胞后发现,衰老小鼠的骨髓间充质干细胞数量较少,增殖能力弱,且形态发生改变。由于衰老小鼠体内骨髓间充质干细胞数量少且传代能力弱,难以得到足够数量的骨髓间充质干细胞,因此本研究通过对8周龄的年轻C57/BL小鼠的BMSCs行过氧化氢处理,制作衰老骨髓间充质干细胞模型,以获得大量衰老骨髓间充质干细胞;并分组使用不同浓度淫羊藿苷、雌激素、雌激素受体拮抗剂来进行对比,在体外研究淫羊藿苷是否能影响衰老骨髓间充质干细胞,以及其是否通过雌激素受体发挥其延缓骨髓间充质干细胞衰老的作用。方法1.衰老C57小鼠以及年轻C57小鼠骨质以及骨折愈合速度对比取16月龄的衰老C57小鼠以及8周龄的年轻C57小鼠,取同侧股骨,行Mirco-CT检测二者指标差异(骨密度、骨表面积等),并取二者骨髓间充质干细胞培养、对比研究。随机选取两组小鼠,于小鼠同侧肢体制作骨折模型,观察二者骨折愈合情况,以及参数差异。2.小鼠骨髓间充质干细胞的提取鉴定以及衰老处理贴壁培养小鼠BMSCs,待培养皿中骨髓间充质干细胞密度达到80%-90%时,取0.25%胰酶消化,2min后加入培养基停止消化,进行传代培养,随后进行免疫荧光鉴定。鉴定后用过氧化氢干预处理造成骨髓间充质干细胞衰老,将细胞分组为对照组以及过氧化氢干预组。用衰老相关-β-半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal)对两组骨髓间充质干细胞进行染色处理,并且用CCK-8法检测对其增殖活性的影响。用蛋白质印迹法(Western Blot,WB)以及PCR(Polymerase Chain Reaction)测定C57小鼠骨髓间充质干细胞对照组与过氧化氢干预组中P53、P21、P16等蛋白指标的变化,并且观察两组成骨蛋白(Runx2、OPG)变化情况。3.淫羊藿苷对于小鼠衰老骨髓间充质干细胞的影响过氧化氢处理骨髓间充质干细胞后,并将其分为4组,在培养基中根据组别添加不同药物,对照组(Control):培养基中加入一定量PBS、淫羊藿苷组(ICA):培养基中加入等量不同浓度的淫羊藿苷、淫羊藿苷加雌激素组(ICA+E):选取最高浓度淫羊藿苷加一定量雌激素、淫羊藿苷加雌激素受体拮抗剂组(ICA+ICI):选取最佳浓度淫羊藿苷加入一定量雌激素受体拮抗剂。分别用CCK-8法检测24h、48h、72h对于衰老骨髓间充质干细胞活力影响。继续培养7天,取细胞用WB、PCR法了解各组P53、P21、P16等衰老指标的变化,用β半乳糖苷酶染色法观察淫羊藿苷处理三天对于β半乳糖苷酶染色阳性细胞率的影响,以及在14天检测成骨相关蛋白(Runx2、OPG)的变化。4.淫羊藿苷对于衰老小鼠骨折愈合的影响将衰老小鼠随机分为衰老对照组以及衰老淫羊藿苷处理组(200mg/kg),制作骨折模型,2周后,取同侧骨折造模股骨,行Mirco-CT检测以及HE切片,对比两组间的愈合情况。结果1.16m的衰老C57小鼠以及8w的年轻C57小鼠相比,骨密度明显下降,骨小梁数量减少。2.16m的衰老C57小鼠以及8w的年轻C57小鼠于同侧制作骨折模型研究发现,衰老小鼠骨折愈合速度相对缓慢。3.16m的衰老C57小鼠以及8w的年轻C57小鼠同时取骨髓间充质干细胞培养发现,衰老小鼠的骨髓间充质干细胞数量少,形态异常,增殖能力较弱。4.骨髓间充质干细胞贴壁生长,形状不规则。5.采取免疫荧光鉴定小鼠骨髓间充质干细胞,发现CD29、CD44阳性表达;CD45几乎不表达。6.用过氧化氢处理骨髓间充质干细胞可以使其衰老,形态发生改变且β半乳糖苷酶染色阳性细胞百分比明显增高,并且增殖活性减弱,且与16m小鼠提取的骨髓间充质干细胞相似。7.ICA可以促进衰老BMSCs增殖,提升其细胞活力。8.对过氧化氢处理组以及对照组做衰老指标WB发现,P53、P21、P16蛋白指标明显升高9.衰老处理组与对照组经过7天以及21天成骨诱导后发现衰老处理组成骨能力下降,茜素红、ALP染色差异明显,且行WB分析发现Runx2、OPG指标下降明显。10.对照组、ICA组、ICA+E组、ICA+ICI组研究发现,ICA组可使BMSCs衰老指标下降,且在一定范围内(10mmol/L-10mmol/L)随着浓度增加而增加;ICA+E组效果与ICA最佳浓度相比差距不大,稍好;ICA+ICI组效果较差,接近于对照组,淫羊藿苷可能是通过ER介导的衰老通路延缓BMSCs衰老。11.通过对照组、ICA组、ICA+E组、ICA+ICI组研究发现,促进成骨能力:ICA+E≥ICA组ICA+ICI组≈对照组。12.衰老小鼠灌胃200mg/kg的淫羊藿苷溶液,可以促进骨折愈合。结论1.衰老小鼠相较年轻小鼠存在骨量下降,骨折愈合时间延长的现象。2.衰老小鼠的BMSCs对比年轻小鼠BMSCs细胞形态发生改变,增殖活力下降。3.BMSCs使用200μmol/L过氧化氢处理两小时后,替换成完全培养基可以使β半乳糖苷酶染色细胞阳性率明显上升,并且可使P53、P21、P16蛋白指标上升,提示过氧化氢处理可以诱导骨髓间充质干细胞衰老的方法的可行性。4.过氧化氢诱导衰老会导致骨髓间充质干细胞成骨能力下降。5.使用ICA可以促进衰老BMSCs衰老相关指标下降,增殖能力恢复,并且可以促进成骨。6.衰老骨髓间充质干细胞分组处理结果显示,ICA浓度在一定范围内(10mmol/L-10mmol/L),骨髓间充质干细胞细胞活力、成骨能力随着ICA浓度的升高而升高。各组中,ICA+E效果最明显,ICA+ICI相较对照组几乎没有效果,提示ICA可能是通过ER介导来发挥其延缓BMSCs衰老的作用。7.200mg/kg的淫羊藿苷溶液灌胃可以促进衰老小鼠骨折愈合。