中药复方肾怡对MRL/lpr小鼠狼疮肾炎的治疗作用及机制研究

作     者：陈铿 

作者单位：广东药科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈香美

授予年度：2022年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：复方肾怡 狼疮性肾炎 LNP023 网络药理学 补体途径 

摘      要：背景与目的:狼疮肾炎(Lupus nephritis,LN)是系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)最严重且最常见的并发症之一,临床症状以免疫亢进及肾功能损伤为主。多数的狼疮肾炎患者最终进展为终末期肾病。目前狼疮肾炎的治疗暂无特效药物,临床主要以激素冲击治疗及免疫抑制剂治疗为主,但是两种主要药物的使用伴随多种严重副作用,且可加重肾脏损伤,发现低副作用且高效的狼疮肾炎治疗药物具有研究意义。研究显示,中药复方肾怡(Chinese herbal compound Shenyi,SY)可纠正机体T细胞比例失衡,调节免疫,抑制肾小球硬化。狼疮肾炎的发病机制以免疫亢进为主,伴随进展为肾小球硬化的终末期肾病风险。使用复方肾怡调节机体免疫,延缓肾小球硬化是否具现实意义。本研究目的是建立狼疮肾炎经典动物模型——MRL/lpr小鼠,研究复方肾怡对MRL/lpr小鼠狼疮肾炎的治疗作用并探讨其治疗机制。方法:研究一:复方肾怡改善MRL/lpr小鼠狼疮肾炎的症状及体征:MRL/lpr小鼠35只,随机分为模型组(MRL/lpr组,n=8)、肾怡低剂量组(SY低剂量组,n=9)、肾怡中剂量组(SY中剂量组,n=9)、肾怡高剂量组(SY高剂量组,n=9)。C57小鼠为正常对照组(正常对照组,n=6)。SY低、中、高剂量组以15.34g/kg/天、46.02g/kg/天、92.04g/kg/天剂量灌胃,正常对照组及MRL/lpr组以0.5ml/天生理盐水灌胃。从12周龄开始干预,1次/日,持续14周。观察各组动物体征、肾脏病理情况、尿蛋白肌酐比值(u PCR)、血清抗核抗体(ANA)、抗双链DNA抗体(anti-ds DNA)浓度、肾脏Ig G、Ig G1、Ig M、C3免疫沉积情况、肾脏组织纤维蛋白表达情况;研究二:复方肾怡通过抑制MRL/lpr小鼠补体激活发挥对狼疮肾炎的治疗作用:MRL/lpr小鼠35只,随机分为模型组(MRL/lpr组,n=8)、肾怡低剂量组(SY低剂量组,n=9)、肾怡中剂量组(SY中剂量组,n=9)、肾怡高剂量组(SY高剂量组,n=9)。C57小鼠为正常对照组(n=6)。SY各剂量组以15.34g/kg/天、46.02g/kg/天、92.04g/kg/天剂量灌胃,正常对照组及MRL/lpr组以0.5ml/天生理盐水灌胃。从12周龄开始干预,1次/日,持续14周。观察各组动物肾脏C4、C5b-9免疫沉积情况、肾脏补体因子蛋白表达情况;研究三:补体因子B抑制剂LNP023改善MRL/lpr小鼠狼疮肾炎:将MRL/lpr小鼠随机分为MRL/lpr模型组(n=6)、LNP023组(n=6),C57小鼠为正常对照组(n=6)。LNP023组以LNP023溶液(30mg/kg/天)灌胃2周;MRL/lpr模型组以Na Cl溶液(0.5ml/天)灌胃2周;正常对照组以Na Cl溶液(0.5ml/天)灌胃2周。分析三组动物外表体征、肾脏病理、肾功能、肾脏免疫复合物及补体沉积、血清anti-ds DNA、血清ANA浓度及补体旁路途径核心补体因子的表达情况;研究四:基于网络药理学探讨中药复方肾怡治疗狼疮肾炎的分子机制:使用TCMSP数据库和上海有机所中药与化学成分数据库筛选SY中的活性成分,运用TCMSP数据库及Swiss Target Prediction数据库收集SY有效成分靶点;使用Gene Cards数据库和OMIM数据库筛选LN疾病靶点,将成分靶点与疾病靶点交集映射,获取治疗靶点。运用METASCAPE数据库对治疗靶点进行GO和KEGG富集分析。结果:(1)与MRL/lpr模型组相比,SY干预的各剂量组动物类狼疮体征减轻、肾脏病理示免疫复合物沉积减少、炎细胞浸润减少、系膜细胞增生减轻,u PCR降低,血清ANA、anti-ds DNA浓度降低,Ig G、Ig G1、Ig M、C3肾脏组织沉积减轻;(2)与MRL/lpr模型组相比,SY干预的各剂量组动物肾脏组织C4、C5b-9免疫沉积减轻。肾脏补体因子C3、C5、CD35表达降低,C5a、C5b表达升高;(3)与MRL/lpr组相比,LNP023组的类狼疮体征减轻,肾功能好转,血清anti-ds DNA、ANA浓度降低,肾脏的Ig M、Ig G、Ig G1、C1q、C3、C4沉积减轻。肾脏病理示LNP023可减轻MRL/lpr小鼠肾脏病理损害,与MRL/lpr模型组相比,治疗组无新月体形成,免疫沉积情况较轻,无核碎裂情况、炎细胞浸润较轻。肾脏组织及肝脏补体蛋白C3、C3b、CR1、CFB、C5b-9表达下降,C5表达上升;(4)SY中共有有效成分77个,有效成分作用靶点497个,LN疾病靶点1112个,SY治疗LN核心靶点236个。其中,AKT1、TNF-a、IL6、TP53等17个为核心靶点。GO、KEGG富集分析显示SY可能通过“AGERAGE、“PI3K-Akt、“IL-17等通路发挥治疗LN的作用。结论:中药复方肾怡改善MRL/lpr小鼠狼疮肾炎的症状体征,作用机制可能为抑制补体通路的激活。补体因子B抑制剂LNP023抑制补体旁路途径的激活改善MRL/lpr小鼠狼疮肾炎。SY还可能通过调节“AGE-RAGE、“PI3K-Akt、“IL-17等信号通路发挥治疗LN的作用。