红树林微生物来源产物Pestalotiopyrone M的免疫抑制活性及靶向CN/NFAT信号通路的作用机制研究

作     者：张雪侠 

作者单位：海南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：徐静

授予年度：2021年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：红树林内生Pestalotiopsis sp Pestalotiopyrone M 钙调蛋白磷酸酶 NFAT信号通路 免疫抑制活性 

摘      要：免疫抑制剂是抑制人体异常免疫反应的生物制剂。目前在超敏反应性疾病、器官移植以及自身免疫疾病中广泛应用。自身免疫性疾病包括风湿性关节炎、红斑狼疮、皮肤真菌病、炎性肠道疾病,以及免疫溶血性贫血等,均可用免疫抑制剂治疗。钙调蛋白磷酸酶（Calcineurin,CN）是一种丝氨酸/苏氨酸特异性磷酸酶,依赖于Ca钙调蛋白进行信号传导。CN被认为是钙调蛋白结合蛋白,不仅调节多种生理功能如T细胞的活化等,而且与一些自身免疫性疾病相关。以CN为靶酶的免疫抑制剂环孢菌素（Cs A）和他克莫司（FK506）的发现成为天然产物免疫抑制剂利用的基础。因Cs A和FK506毒副作用较大,因此从天然产物中研究出高效低毒的免疫抑制剂具有非常重要的意义。红树林是分布在世界热带和亚热带地区的独特沿海森林生态系统,由于低氧气、高盐度和高温的恶劣环境,红树林以独特的自适应能力和不断发展的次生代谢途径可能产生结构多样的次级代谢物,这些代谢物的功能是多种生物活性的来源,在医药中起着重要作用。植物内生真菌栖息在健康的植物组织中,而不引起的植物腐败和明显的疾病。红树林内生真菌是第二大海洋真菌群体,包含有结构丰富的次级代谢产物并且具有多种药理活性。红树林内生真菌为先导化合物的开发指明了新的方向。从红树林内生真菌中分离出的多种次级代谢产物能产生抗炎症、抗菌、抗肿瘤和免疫抑制活性等。所以红树林内生真菌是天然药物研究和开发时非常重要的资源。本研究选用测定钙调蛋白磷酸酶活性的方法,对红树林微生物来源的产物进行免疫抑制活性的筛选,发现红茄苳内生烟曲霉次级代谢产物4个单体化合物、大红树拟茎点霉菌次级代谢产物5个化合物和红海榄拟盘多毛孢中次级代谢产物1个新化合物均具有免疫抑制活性。中国红树植物红海榄（Rhizophora stylosa）内生拟盘多毛孢菌Pestalotiopsis sp HHL101分离出来的吡喃酮类新化合物Pestalotiopyrone M（简称为PyM）能够有效地抑制钙调磷酸酶活性,且呈现剂量依赖性的抑制作用。在3种红树林微生物来源单体中,PyM对正常淋巴细胞毒性最小、免疫活性显著且是世界首次发现的新化合物。因此,本研究中我们选用具有低毒性和显著免疫抑制活性的PyM进行后续免疫抑制作用的研究。本研究旨在研究PyM在小鼠淋巴细胞的免疫抑制活性及其靶向钙调蛋白磷酸酶相关NFAT信号通路的作用机制。前期研究证明PyM对钙调蛋白磷酸酶具有显著的抑制活性(IC为19.67±0.08μM),并且对小鼠脾细胞显示较低的细胞毒性(IC为385.78±17.90μM)。PyM可以有效抑制Con A诱导的小鼠脾淋巴的增殖(IC为46.77±0.68μM),表明PyM能够有效抑制T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖。PyM对单向混合淋巴细胞反应也起抑制作用(IC为42.67±1.00μM),表明该化合物对免疫排斥反应也有抑制。我们使用PI（碘化丙啶）染色检测细胞周期分布情况,发现PyM可以抑制脾细胞细胞周期从G1期进入S期和G2期,说明PyM可以抑制小鼠淋巴细胞有丝分裂和细胞增殖。Annexin V-FITC/PI双染显示,PyM对小鼠脾细胞作用后,早期凋亡和晚期凋亡细胞的比例增多,说明PyM以浓度依赖性使细胞发生细胞凋亡。CN/NFAT途径是与免疫相关的最重要的信号通路之一,免疫荧光法证实PyM抑制NFAT信号通路上NFAT1蛋白的核转移。反转录PCR和实时定量PCR实验表明PyM对NFAT信号通路上的IL-2的m RNA也发挥抑制作用。我们进一步使用Western Blot实验证明PyM显著抑制NFAT1蛋白的表达情况。酶联免疫吸附测定（ELISA法）同样也证实了PyM对NFAT信号通路相关的细胞因子发挥抑制作用,对细胞白介素-2（IL-2）、细胞白介素-4（IL-4）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-α（INF-α）具有不同程度的抑制作用。这些结果表明PyM是以CN酶为靶酶参与NFAT信号通路上的免疫抑制作用,因此PyM可以做为潜在的免疫抑制剂的先导物,为天然来源高效低毒免疫抑制剂的开发与利用提供了可能。