基于UPLC-MS代谢组学探讨补肾治法抗LOD作用机制

作     者：许汉芳 

作者单位：广州中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：严灿

授予年度：2023年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：迟发性抑郁症 代谢组学 鞘脂代谢 神经酰胺 补肾治法 

摘      要：目的: 本研究旨在通过建立迟发性抑郁症(late-onset depression,LOD)大鼠模型,通过整体动物行为学实验观察大鼠抑郁样行为,运用UPLC-MS代谢组学技术检测大鼠体内的差异代谢物并富集重要代谢通路,采用生物分子学技术验证关键靶点,探讨补肾治法代表复方二仙汤(Erxian Decoction,EXD)抗LOD的作用机制。 方法: 1.动物模型的建立 本研究中抑郁症模型采用慢性不可预计轻度应激(chronic unpredictable mild sress,CUMS)模型;LOD模型采用自然衰老合并CUMS建立。CUMS应激源包括:频闪(300次/min,5 h)、白噪音(85 db,5 h)、足底电击(1 mA,2 s/次,每次间隔30s,共电击10次)、湿笼(10 h)、并笼(4只接受应激的大鼠放入同一鼠笼,10 h)、夜晚持续光照(20:00-次日8:00,12 h)、禁食(12 h)、禁水(12 h)、束缚(12 h)、禁食禁水(24 h)等。每日随机施加1-2种应激源并结合孤养,3天内避免出现相同的应激源。 2.观察LOD大鼠抑郁症状及认知障碍及二仙汤的干预作用 本实验中共有7-8周龄青年正常雄性Wistar大鼠40只,20月龄自然衰老雄性Wistar大鼠60只。根据造模前的糖水偏爱度来进行分组:青年大鼠分为青年正常对照组(CON)和青年抑郁症组(CUMS),每组20只大鼠;自然衰老大鼠共分为3个组,分别为自然衰老对照组(AGED)、迟发性抑郁症组(LOD)和二仙汤治疗对照组(EXD),每组20只大鼠。所有大鼠共计分为5组。除CON组和AGED组,其余组别均接受6周的CUMS应激。造模期间EXD组给予二仙汤(8 g/kg/d)灌胃治疗,其余组别给予等量纯净水灌胃。6周CUMS应激造模结束后,通过一系列动物行为学测试观察各组大鼠的抑郁样行为和认知功能。其中糖水偏爱实验检测快感缺失、旷场实验检测自主活动、强迫游泳实验评估绝望情绪、Morris水迷宫和T迷宫检测空间和方位的学习记忆能力。 3.基于大鼠海马、前额叶皮质、血清的UPLC-MS代谢组学探讨二仙汤抗LOD的作用机制 采用UPLC-MS代谢组学技术,对大鼠海马、前额叶皮质及血清中的代谢物质进行检测,并筛选出各组间的差异代谢物(VIP1,P0.1,P0.05)。 4.观察LOD大鼠海马和前额叶皮质中神经酰胺代谢变化与细胞凋亡的关系及二仙汤干预作用 基于UPLC-MS代谢组学结果,采用酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组大鼠海马和前额叶皮质中神经酰胺(Ceramide,Cer)的含量。运用免疫荧光法(Immunofluorescence,IF)和蛋白免疫印迹法(Western-blot,WB)检测CON组、LOD组和EXD组大鼠海马和前额叶皮质中Cer的平均荧光强度表达和蛋白相对含量表达,以及细胞凋亡Tunel的平均荧光强度表达。 5.观察LOD大鼠海马和前额叶皮质中神经酰胺的代谢机制及二仙汤干预作用 采用ELISA法检测CON组、LOD组和EXD组大鼠海马和前额叶皮质中鞘磷脂(Sphingolipids,SM)、鞘氨醇(Sphingosine,Sph)、二氢神经酰胺(Dihydroceramide,dhCer)和葡萄糖神经酰胺(Glucosylceramide,GluCer)的含量;IF 法和 Western-blot法检测CON组、LOD组和EXD组大鼠海马和前额叶皮质中酸性鞘磷脂酶(Acid sphingomyelinase,ASM)和酸性神经酰胺酶(Acid ceramidase,ACD)的平均荧光强度表达和蛋白相对含量表达。 结果: 1.行为学结果显示,CUMS组和LOD组大鼠出现明显的抑郁样行为,具体表现为:快感缺失、自发活动减少、绝望和焦虑情绪增加。同时还伴随空间和方位学习记忆障碍,且LOD大鼠更为明显。 ***-MS代谢组学结果显示:(1)在海马中,LOD组和CON组两组间共鉴定出165种差异代谢物,其中76种上调和89种下调;EXD组和LOD组两组间共鉴定出70种差异代谢物,其中40种上调和30种下调;LOD组和CON组以及EXD组和LOD组之间有31种交叉代谢物,主要涉及到2个潜在生物学通路:鞘脂代谢和甘油磷脂代谢这2个通路,其中包括潜在生物标志物:硬脂酰鞘氨醇(C18神经酰胺)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、以及磷脂酰胆碱。(2)在前额叶皮质中,LOD组和CON组两组间共鉴定出189种差异代谢物,其中95种上调和94种下调;EXD组和LOD组两组间共鉴定出71种差异代谢物,其中17种上