制麦过程中微生物群落分析及其对麦芽质量的影响

作     者：张雷渊 

作者单位：贵州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：谢和

授予年度：2022年

学科分类：08[工学] 0822[工学-轻工技术与工程] 082203[工学-发酵工程] 

主      题：制麦 微生物群落结构 高通量测序 可培养微生物 麦芽质量 

摘      要：啤酒是人类已知的最古老的饮料之一,是一种“以麦芽为主要原料,添加啤酒花,用纯种酵母进行发酵而生产的一种低酒精饮料。目前,我国已成为世界上啤酒生产与消费的超级大国。随着生活品质的提高,人们对中高档啤酒的需求越来越大,麦芽品质日益受到关注与重视。麦芽制造是指在人工控制的条件下,啤用大麦经浸泡、发芽和干燥等制麦工艺制成麦芽的过程,是一个复杂的生物过程。其中除了大麦自身发芽促进酶系的合成和籽粒结构的降解以外,还包括了丰富的微生物菌群的生长繁殖。在制麦过程中,这些微生物之间的相互作用及其发生的一系列复杂的代谢和生化反应,使得微生物群落在制麦过程中与谷物代谢相互作用,最终影响着麦芽产品的质量。但对于微生物菌群在制麦过程中的具体演替情况和功能机制尚不清楚。另外,由于相对开放的制麦环境和并非无菌的大麦原料,制麦过程中存在受一些不利微生物污染的风险,进而导致相同生产工艺下依然会出现不同批次之间麦芽质量不稳定的情况。为了抑制有害菌和改善麦芽特性,部分特性良好的微生物菌种已成功应用于麦芽生产中。然而,目前合适的制麦微生物资源仍然极为缺乏。针对上述问题,本论文利用高通量测序技术结合传统分离培养法,科学深入地解析制麦过程中复杂的微生物群落,揭示微生物种类组成和多样性,更好地理解微生物群落演替的潜在机制,将有助于制麦微生态的管理与优化,以保证麦芽产品质量。此外,挖掘更多制麦过程中的功能性微生物资源和探究不同微生物的潜在危害性,并在实际生产中加以控制,是提高麦芽产品质量稳定性及安全性的有效途径之一。本论文主要研究内容和结果如下:(1)基于高通量测序对制麦过程中微生物群落结构与多样性分析以不同制麦阶段的样品中微生物群落为研究对象,基于Miseq二代测序数据,分析其群落多样性、组成结构及动态演替,此外采用多元统计分析揭示微生物群落之间的潜在相关关系及其功能机制。制麦样品中共检出2个真菌门的57个真菌属和4个优势细菌门的65个细菌属,明确了unclassified＿o＿Saccharomycetales、线黑粉酵母属(Filobasidium)、链格孢属(Alternaria)、假丝酵母属(Candida)等13个属为制麦过程中的优势真菌属;不动杆菌属(Acinetobacter)、泛菌属(Pantoea)、乳球菌(Lactococcus)、魏斯氏属(Weissella)等15个属为制麦过程中的优势细菌属。多样性分析发现,制麦过程中微生物多样性及丰富度在浸麦阶段急剧变化,之后逐渐趋于稳定状。由群落结构组成分析结果可以看出,制麦过程中各样本的优势微生物群落结构组成差异不大,但样本中不同菌属相对丰度随着制麦程序的进行而变化,这可能和微生物与制麦过程中环境条件的相互作用有关。此外,也与各个微生物之间的相互作用有关。通过相关性网络分析,共获得44个节点和133对显著相关关系。其中12个节点的连接度≥10,并将其归为共现微生物群。包括了8个细菌属和4个真菌属。在一定程度上揭示了各种复杂微生物之间的相关关系与其他非生物因素共同参与驱动制麦过程中微生态的演替变化。基于扩增子测序结果,对制麦过程中细菌群落进行表型功能预测,结果发现,制麦过程中兼性厌氧细菌相对丰度大于好氧细菌,革兰氏阴性菌相对丰度大于革兰氏阳性菌。且革兰氏阴性菌、生物膜形成、潜在致病菌和胁迫耐受四种表型细菌在制麦过程中相对丰度变化趋势一致,这些细菌可能对麦芽质量特性以及安全性造成影响。真菌功能预测表明,大麦籽粒中,真菌功能营养型主要是以动物病原体-内生菌-植物病原体-木质腐生菌为主。但在浸麦后的制麦过程中,主要是腐生营养型为优势功能型。这类腐生菌群能通过辅助降解大麦细胞壁以获取营养物质。(2)制麦过程中可培养微生物的分离鉴定通过传统的平板分离方法,利用形态学观察结合微生物DNA序列分析,对制麦过程中各类可培养微生物进行分离纯化和鉴定。在不同制麦阶段采集的样品中共分离到108株真菌,初步鉴定为2门6纲11个目的24个真菌种。共分离得到103株可培养细菌,初步鉴定为3个门3个纲7个目11个科的19个细菌种。利用MRS培养基平板分离纯化得到革兰氏染色阳性,触酶试验阴性的乳酸菌共37株,初步鉴定为2个科4个属的7个种。结果表明,在整个制麦生态系统中存在着丰富的微生物资源,这些微生物在制麦生态系统中扮演着各种重要的角色,对麦芽产品的质量有着不同程度的影响。(3)制麦生态系统来源真菌其胞外酶活性的初步研究利用平板筛选法对探究制麦过程中可培养真菌的蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和纤维素酶四种水解酶活性进行筛选。共筛选到16种产酶菌株,6种真菌产蛋白酶,6种产淀粉酶,7种产木聚糖酶和12种产纤维素酶的真菌菌株。结果表明,真菌群落是麦芽水解酶系的潜在生产者。如Cladosporium halotolerans蛋白酶和纤维素酶活性较强,Alternaria sorghi显示出较高的木聚糖酶活性,Rhodotorula mucilaginosa能较好的分解淀粉。(4)4株优势细菌的侵染对麦芽品质的影响结合第二章高通量测序结果与第三章分离鉴定结果,筛选到4株优势细菌。将优势细菌菌悬液接种至浸麦水中,模拟制麦过程中受细菌污染。制麦后分析麦芽糖化力、库值、α-氨基氮等麦芽主要品质指标,以明确优势细菌对麦芽主要品质性状的影响及差异。结果表明,属于革兰氏阴性菌的三株优势细菌:栖稻假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)、约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)和赫尔曼埃希菌(Atlantibacter hermannii)侵染会降低麦芽库值及麦汁α氨基氮含量,影响麦芽蛋白质降解。并且显著降低了麦芽糖化力和浸出率,严重影响后续的麦汁发酵。其中约氏不动杆菌(A.johnsonii)的影响最为显著。虽然属于革兰氏阳性菌的谷氨酸杆菌(Glutamicibacter mishrai)的侵染对麦芽质量影响较小,但也会使麦汁浊度显著升高。4株菌株侵染均引起麦汁浊度的上升,其中约氏不动杆菌(A.johnsonii)的影响最大。此外,还发现细菌侵染对不同基因型大麦品种的麦芽质量影响程度有所差异。