Plk1在磷酰胺氮芥致卵巢颗粒细胞损伤中的作用及机制

作     者：黄欣怡 

作者单位：湖南中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙晓峰

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100211[医学-妇产科学] 10[医学] 

主      题：RNA-seq 生信分析 卵巢颗粒细胞 磷酰胺氮芥 Plk1 

摘      要：目的:磷酰胺氮芥(Phosphoramidemustard,PM)损伤卵巢颗粒细胞(Granulosa cells,GCs)的分子机制具有复杂多样性,具体基因与作用信号通路尚不清楚。本课题基于RNA-seq技术和生物信息学研究PM损伤GCs的关键基因及潜在机制,并通过体外实验探究关键基因对细胞功能的调控和对下游信号通路的作用。方法:1.通过体外实验,以正常卵巢GCs作为对照,对PM损伤后GCs进行CCK8和流式细胞术评估细胞活性及细胞凋亡率;通过RNA-seq和生物信息学对测序数据进行分析,对差异基因采用GO、KEGG pathway富集分析,对基因集进行GSEA富集分析,构建PPI网络识别枢纽基因,以找到损伤机制之关键基因。2.在GCs中对关键基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Plk1(Polo-like Kinase 1,Plk1)进行过表达,将分组设为正常组(Control)、PM组(PM)、过表达空载组(OE-NC)、过表达空载+PM组(OE-NC+PM)、过表达Plk1组(OE-Plk1)、过表达Plk1+PM组(OE-Plk1+PM),通过CCK8、Ed U染色、流式细胞术检测凋亡及细胞周期,探讨过表达后GCs细胞功能改变。3.通过q RT-PCR和Western-blot检测Bax、Bcl-2、Caspase-3的mRNA及蛋白变化,Western-blot检测p-AKT表达水平。结果:1.测序结果表明正常组与PM组相比共有1261个差异表达基因,其中715个表达上调,546个表达下调。对差异基因进行GO功能富集分析(GO Enrichment Analysis,GO)富集,生物过程方面主要富集在染色体分离、核分裂、细胞器分裂等方面;细胞组分方面主要富集在浓缩染色体、染色体着丝粒区、染色体区域等方面;分子功能方面主要富集在催化活性、受体配体活性、催化活性,作用于DNA等。对差异基因进行京都基因与基因组百科全书KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集,下调基因包含DNA复制、细胞周期、白细胞介素-17信号通路等;上调基因包含MAPK信号通路、细胞色素P450对外源物质代谢的影响、化学致癌-受体激活通路等。基因集GSEA(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)富集结果包含细胞周期、白介素17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等。2.PM组与正常组相比、OE-NC+PM组与OE-NC组相比、OE-Plk1+PM组与OE-Plk1组相比细胞活性减弱、细胞增殖能力降低、细胞凋亡率增加、细胞周期紊乱(p0.05);OE-Plk1+PM组与PM组及OE-NC+PM组相比,细胞活性增加、细胞增殖能力提高、细胞凋亡率减少、改善细胞周期紊乱(p0.05)。3.PM组与正常组相比、OE-NC+PM组与OE-NC组相比、OE-Plk1+PM组与OE-Plk1组相比,Bax、Caspase-3 mRNA水平升高,Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白水平升高、Bcl-2 mRNA及蛋白水平降低,p-AKT蛋白水平降低(p0.05)。OE-Plk1+PM组与PM组及OE-NC+PM组相比,Bax、Caspase-3 mRNA水平降低,Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白水平降低,Bcl-2 mRNA及蛋白水平升高、p-AKT蛋白水平升高(p0.05)。结论:1.通过RNA-seq技术和生物信息学确定PM损伤GCs涉及多基因、多信号通路,其中Plk1为关键基因。2.过表达Plk1可抑制PM损伤GCs产生的细胞凋亡,促进细胞增殖。3.过表达Plk1通过激活AKT途径,上调Bcl-2、下调Bax及Caspase-3抑制PM导致的GCs细胞凋亡。