静电相互作用介导的超电荷荧光蛋白自组装

作     者：颜淑婷 

作者单位：湖南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：黄燕

授予年度：2021年

学科分类：081703[工学-生物化工] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 070304[理学-物理化学(含∶化学物理)] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0703[理学-化学] 0836[工学-生物工程] 

主      题：蛋白自组装 静电相互作用 分子动力学模拟 pGFP pCFP pYFP 

摘      要：蛋白质在生命体内广泛存在,是构成生命体结构和功能复杂性的关键。其中,大多数天然蛋白质会自发组装成多层次结构,如1D微管、2D细菌表面层和3D病毒衣壳。这些组装体在生命系统中发挥着重要作用,并为构建具有广泛应用前景的新型纳米材料提供了设计模板。与DNA和RNA组装领域取得的巨大成就相反,蛋白质组装领域由于蛋白质尺寸大、相互作用复杂而进展缓慢。荧光蛋白具有相对刚性的β折叠桶结构,经表面重构技术对其表面的非保守氨基酸重新设计,可获得各种不影响原有功能、且带有不同正或负电荷的超电荷荧光蛋白。发展基于静电相互作用的超电荷荧光蛋白自组装将有望进一步拓展蛋白组装元件的选择范围。然而,静电相互作用驱动的蛋白质组装不仅需要蛋白与其他组分的表面带电量相反,还对蛋白表面电荷分布情况和界面间相互作用强度有较高的要求,该方案的实现,关键在于蛋白序列的设计以及组装条件的摸索。为了发展静电相互作用介导的超电荷荧光蛋白自组装新方法,本文对超折叠绿色荧光蛋白(sf GFP)的性质进行了深度调研。鉴于sf GFP的稳定结构、独特光谱特性和表面可设计性,我们通过对sf GFP表面重构,构建了一端带15个正电荷、一端带10个负电荷的极性绿色荧光蛋白(p GFP)。通过异源表达、纯化p GFP,并探究它的最佳组装条件,获得了在溶液中尺寸达到微米级别的长方体形貌的组装体,实现了荧光蛋白的光谱特性与可自组装性的巧妙结合。利用GROMACS分子动力学模拟技术模拟蛋白对接结果,基于此分析的蛋白间相互作用辅助了我们对组装过程的理解。另外,以p GFP序列作为模板,获得了具有不同颜色、且可自组装的突变体,并将满足供体发射光谱与受体吸收光谱重叠性的荧光蛋白组装体构建成FRET对。具体研究内容如下:1、p GFP的体外表达和自组装性能研究。构建p ET28a-pgfp重组质粒并在体外成功表达和纯化p GFP。通过优化组装条件,确定了p GFP在蛋白终浓度为1μM,温度为4℃,组装时间为2 d能自发组装成微米级别的长方体结构。组装过程受溶液中Na Cl浓度与p H值的调节可逆变化,证明了该组装行为受静电相互作用驱动。当组装时间延长至50 d时,单个组装体平均长度能生长至50.2μm。组装体的这些性能使其在药物释放领域具有潜在应用价值。2、p GFP自组装行为的分子动力学模拟研究。通过从空间结构和能量维度对建模结果进行评价,确定了SWISS-MODEL方法构建的sf GFP和p GFP模型是最优模型。在明确最优结构模型的基础上,利用刚性对接技术获得几何和能量上匹配的初始结合模型(sf GFP1+1、p GFP1+1和p GFP2+2),并对这些结合模型分别进行GROMACS分子动力学模拟。结合自由能结果证明了促进p GFP分子间聚集的主要能量贡献来源于静电相互作用能,实现了从微观层面解释p GFP的自组装行为,为基于荧光蛋白自组装的普适化设计奠定基础。3、基于荧光蛋白自组装体FRET对的构建和性能优化。首先,利用定点突变技术构建重组质粒p ET28a-pcfp和p ET28a-pyfp,并在体外表达p CFP和p YFP。随后,在p GFP的最佳组装条件基础上探究了p CFP和p YFP的最佳组装条件(蛋白终浓度为3μM,温度为4℃,组装时间为3 d),形成的组装体同样表现为微米级别的长方体结构。接着通过分子模拟技术分析两种突变体自身间相互作用的差异,从而解释不同颜色蛋白自组装体长宽比存在差异的原因。并证明了组装后的p CFP和p YFP具备构建FRET对的可行性。随后,构建和比较了由不同混合组装方式设计的FRET对,并将不同实验组的FRET Ratio值均优化至超过2.5,其中该值最高为21.43(先单独组装p YFP 30 d,再加入p CFP组装18 d)。这样不仅丰富了荧光蛋白FRET对的构建方式,甚至为后续FRET传感平台的设计提供了全新思路。