湖南部分地区PCV2的遗传进化分析及不同基因型毒株体外复制的差异研究

作     者：张露华 

作者单位：湖南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：湛洋

授予年度：2022年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：猪圆环病毒2型 进化分析 蛋白质结构 体外复制特性 

摘      要：猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）在临床上引起猪圆环病毒相关疾病（Porcine circovirus associated disease,PCVAD）,广泛流行于全国各地,给养猪业造成重大经济损失。在选择压力下,PCV2呈现出高频率的突变,导致新基因型的不断产生与流行,为临床上病毒的净化加大了难度。为了解湖南省部分地区流行的PCV2基因型和其进化与突变规律,并分析不同PCV2基因型毒株体外复制的差异,我们进行如下研究:1.对湖南省14个地区的223份组织样品进行PCV2分子流行病学调查,结果显示PCV2阳性率为51.27%（115/223）,且存在多病原混合感染的情况,其中PCV2与PPV,PCV2与PRRSV的混合感染率最高,均达到16.52%（19/115）。通过分子克隆与测序,在上述阳性样本中获得43株PCV2全长基因组序列,系统进化树分析表明这些毒株中3株为PCV2a（6.98%）,23株为PCV2b（53.49%）以及15株为PCV2d（34.88%）。此外,遗传进化和验证分析结果表明有2个毒株存在PCV2b与PCV2d的基因重组现象。2.基于Cap蛋白质一级结构比对和三维结构模拟分析,发现所获得的PCV2毒株Cap蛋白质中Loop DE、Loop FG以及NLS区域相对保守,而Loop BC、Loop CD、Loop GH、Loop HI区域存在多个突变热点;结合PCV2衣壳表面结构特征分析,发现从PCV2a向PCV2b再向PCV2d进化的过程中,衣壳表面五倍轴及其附近高峰区域（Loop EF和羧基端）内正电荷氨基酸逐渐增多,因此推测这种变化规律有利于病毒与带负电荷的受体（如硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素B）结合。对流行毒株的Cap蛋白质氨基酸序列进一步分析,发现部分关键氨基酸突变位点位于糖胺聚糖受体结合区域中,如位点59、63、68、134、169;此外,部分关键氨基酸突变位点位于中和抗体抗原表位,如位点59、131、151、190、191。PCV2 Rep蛋白质氨基酸序列则相对保守,仅个别位点出现高突变率,这些突变对病毒生物学功能的影响有待进一步研究。3.基于获得的PCV2毒株全长基因组序列,本研究构建了5个PCV2的感染性克隆质粒（PCV2a-LY1908、PCV2b-YY1908.3、PCV2b-CD1922、PCV2d-YY1908.1、PCV2d-WZ1901.4）,包括了3种PCV2不同的基因型,同时使用本团队前期构建的感染性克隆质粒PCV2a-KJ437192,将以上6个感染性克隆质粒转染PK-15细胞,以研究不同基因型毒株的病毒拯救与体外复制能力的差异。结果显示:毒株PCV2b-CD1922、PCV2d-YY1908.1和PCV2d-WZ1901.4的感染性克隆拯救出病毒并在传代细胞中稳定存在;毒株PCV2b-YY1908.3和PCV2a-KJ437192能拯救出病毒,但随着细胞的传代,病毒的含量逐渐降低;毒株PCV2a-LY1908无法被拯救。获得的拯救病毒中,PCV2b-CD1922与PCV2d-YY1908.1具有较高的病毒滴度,均高于10～5TCID/ml,对其进行诱导PK-15细胞凋亡现象与复制动力学研究,结果表明,两株毒株均能诱导细胞凋亡,但无显著性差异;两株毒株均具有良好的细胞内复制特性,且毒株PCV2d-YY1908.1的复制能力优于毒株PCV2b-CD1922。