甘金解毒癒疡含漱液开发研究

作     者：黄春桃 

作者单位：广西中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邓家刚

授予年度：2021年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：甘金解毒癒疡含漱液 制备工艺 质量标准 药效 安全性 

摘      要：目的:甘金解毒癒疡含漱液由金花茶叶、甘蔗叶等中药组成,是全国名老中医药专家学术经验继承工作指导老师邓家刚教授组的方,具有清热解毒,祛腐癒疡的功效,可用于治疗肿瘤化疗后口腔火毒蚀肉,糜烂疼痛,津伤咽干。本课题按照医疗机构制剂的申报要求,将中医药理论与现代科学技术结合,优选该产品的制备工艺,制定一套稳定、可控、合理的质量标准,并对其药效作用及安全性进行研究,为该产品申报医疗机构制剂提供实验数据,为研发中医药特色的含漱剂提供参考。方法:1.制备工艺研究:采用紫外-可见分光光度法测定甘金解毒癒疡含漱液总多糖的含量;建立一测多评（QAMS）法测定甘金解毒癒疡含漱液原儿茶酸、咖啡酸、异嗪皮啶、菊苣酸、Okicamellia、迷迭香酸的含量;采用单因素试验,对提取时间、提取次数、料液比3个因素分别进行考察,再结合正交设计实验L（3）,以总归一值（OD值）为评价指标,优选最佳制备工艺。2.质量标准研究:参照《中国药典》2020年版技术质量规范,考察含漱液性能指标;采用薄层鉴别技术（TLC）鉴别甘金解毒癒疡含漱液中金花茶叶、甘蔗叶等五味药,从薄层板、展开剂、显色剂、温度、湿度等影响因素中筛选最优的薄层色谱条件;采用高效液相色谱法建立甘金解毒癒疡含漱液的指纹图谱;采用QAMS法测定了甘金解毒癒疡含漱液中原儿茶酸、咖啡酸、异嗪皮啶、菊苣酸、Okicamellia、迷迭香酸六种成分的含量,并制定各成分的含量限度。3.药效研究:通过建立金黄地鼠化疗性口腔黏膜炎模型,观察甘金解毒癒疡含漱液对化疗性口腔黏膜炎模型金黄地鼠一般状态的影响,并对金黄地鼠的颊囊炎症情况进行评分;ELISA法检测金黄地鼠血清肿瘤坏死因子γ（TNF-γ）、白细胞介素1（IL-1）、白细胞介素6（IL-6）、干扰素α（IFN-γ）水平;HE染色观察金黄地鼠颊囊组织病理改变;免疫组化法检测金黄地鼠颊囊组织中基质金属蛋白酶9（MMP-9）、环氧化酶2（COX-2）、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）蛋白表达水平。3.安全性评价:甘金解毒癒疡含漱液的急性毒性试验采用小鼠和大鼠两种动物,分别研究灌胃给药毒性和口腔给药毒性。按最大给药量法,小鼠用甘金解毒癒疡含漱液（浓度为1.09 g/ml）灌胃给药,灌胃容积为0.3 ml/10 g;大鼠用甘金解毒癒疡含漱液（浓度为1.09 mg/ml）口腔给药0.5 ml/次,4次/d,观察给药前后情况。甘金解毒癒疡含漱液的局部毒性试验,选用新西兰大白兔和豚鼠,分别进行甘金解毒癒疡含漱液的皮肤刺激试验和过敏试验。结果:1.制备工艺研究:建立了甘金解毒癒疡含漱液总多糖的测定方法,总多糖的线性范围为0.01147 mg～0.1147 mg（R=0.99979）,精密度RSD为0.45%,重复性RSD为0.64%,稳定性RSD为0.45%,加样回收率RSD为0.93%;建立了QAMS法测定甘金解毒癒疡含漱液原儿茶酸、咖啡酸、异嗪皮啶、菊苣酸、Okicamellia、迷迭香酸的含量,原儿茶酸、咖啡酸、异嗪皮啶、菊苣酸、Okicamellia、迷迭香酸线性范围分别为12.02～120.18μg/ml（R=0.99995）、25.92～259.20μg/ml（R=0.99998）、18.40～184.00μg/ml（R=0.99995）、109.98～1099.80μg/ml（R=0.99996）、46.65～466.48μg/ml（R=0.99966）、14.00～140.00μg/ml（R=0.99997）,精密度RSD分别为0.14%、0.14%、0.18%、0.24%、0.21%、0.44%,稳定性RSD分别为0.52%、0.93%、1.29%、1.29%、1.52%、1.04%,重复性RSD分别为0.91%、0.56%、0.94%、0.92%、1.06%、1.08%,加样回收率RSD分别为1.49%、0.63%、1.61%、1.72%、0.66%、1.76%,原儿茶酸、咖啡酸、异嗪皮啶、Okicamellia、迷迭香酸相对校正因子RSD分别为0.44%、0.10%、0.66%、0.93%、0.99%;根据总评价归一值并结合实际成本考虑,选定提取时间1、1.5、2 h,提取次数2、3、4次,料液比1:15、1:20、1:25倍进行正交设计实验,正交实验方差分析表明各因素对提取效果均无显著性影响（P0.05）,综合评分表明最佳制备工艺为取时间1.5 h,提取次数4次,料液比1:15倍;验证实验结果表明,3次重复实验归一化平均值为0.91,RSD为2.71%,说明该制备工艺稳定,合理。2.质量标准研究:通过对甘金解毒癒疡含漱液性能指标的考察可知含漱液具薄荷香味、澄清、pH（25℃）范围3.8～4.2、相对密度（20℃）1.0012～1.0032,于4℃贮存24 h,少许冻结;40℃贮存24 h无浑浊,色泽稳定;采用薄层色谱法对甘金解毒癒疡含漱液中的金花茶叶、甘蔗叶等5味药材进行定性鉴别,建立了各药味的薄层色谱方法,结果表明该方法专属性强;通过高效液相色谱建立了10批甘金解毒癒疡含漱液指纹图谱,结果共标定了17个共有峰,10批甘金解毒癒疡含漱液指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均大于0.97,说明指纹图谱重复性好;采用QAMS法测定了甘金解毒癒疡含漱液中原儿茶酸、咖啡酸、异嗪皮啶、菊苣酸、Okicamellia、迷迭香酸六种成分的含量,并制定其含量限度为本品1ml中原儿茶酸不得少于50μg、咖啡酸不得少于100μg、异嗪皮啶不得少于50μg、菊苣酸不得少于90μg、Okicamellia不得少于50μg、迷迭香酸不得少于30μg。3.药效研究:采用化疗性口腔黏膜炎模型研究甘金解毒癒疡含漱液的药效,结果显示,甘金解毒癒疡含漱液对化疗性口腔黏膜炎有良好的治疗作用,与模型组比较,甘金解毒癒疡含漱液高、中、低剂量组均可显著减轻造模导致的金黄地鼠颊囊黏膜炎症状评分（P0.05或P0.01）,显著降低金黄地鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6水平（P0.01）,显著升高金黄地鼠血清IFN-γ水平（P0.05或P0.01）,改善颊囊黏膜病理结构改变,显著降低金黄地鼠颊囊黏膜组织MMP-9、COX-2、PARP蛋白的表达（P0.01）。4.安全性评价:在急性毒性试验中,小鼠灌胃结束10 min后,小鼠出现运动不协调,随后俯卧不移动,但无痉挛、局部麻痹或僵直,小鼠呼吸正常;20 min后,小鼠恢复正常活动,在观察期间动物饮食、摄水、活动正常。按临床成人计算,要口服进入体内达到32.7 g/kg才会出现以上情况,但本品临床应用为口腔外用含漱剂,浓度只有0.163 g/ml,一天用量约30 ml,给药量以及可吸收至全身的量少;从病理切片结果显示,甘金解毒癒疡含漱液组各脏器（心、肝、脾、肺、肾）形态结构无明显病理改变现象;大鼠口腔给药未发现全身状况及口腔黏膜异常,同时病理切片结果显示,甘金解毒癒疡含漱液组各脏器（心、肝、脾、肺、肾）形态结构无明显病理改变现象。在局部毒性试验中,皮肤刺激实验结果显示,单次给药及多次给药甘金解毒癒疡含漱液,在完整皮肤及破损皮肤区均未出现红斑、水肿等刺激反应;在豚鼠过敏试验结果显示,甘金解毒癒疡含漱液在皮肤用药,不引起过敏反应。结论:本课题研究的甘金解毒癒疡含漱液制备工艺合理、可行、稳定;制剂质量可控、稳定;对化疗性口腔黏膜炎有良好的治疗作用;同时表明甘金解毒癒疡含漱液在口腔局部用药是安全的。