过氧化物酶检测新生儿血清游离胆红素方法学的建立及临床应用

作     者：黄益础 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨传忠

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100202[医学-儿科学] 10[医学] 

主      题：新生儿黄疸 血清游离胆红素 过氧化物酶试验 胆红素诱导神经毒性 脑干听觉诱发电位 

摘      要：研究背景新生儿黄疸(neonatalj aundice,NNJ)是新生儿早期常见的临床问题,严重者可出现胆红素脑病(bilirubin encephalopathy,BE),对神经系统造成永久性损害,甚至致死。血清游离胆红素(unboundbilirubin,UB)是公认的胆红素神经毒性因子,危险水平的UB可穿透血脑屏障侵染中枢神经系统中特定的解剖区域(包括苍白球、丘脑下核等)诱导神经元凋亡和坏死。越来越多的临床研究证实,UB对胆红素脑损伤的发生极具预测价值,尤其与胆红素所致的听力损伤相关。血清UB可通过过氧化物酶(peroxidase,POD)法定量分析,其主要原理为酶促反应动力学与分光光度法的结合。国内鲜有UB检测的报道,为进一步优化新生儿黄疸的管理,亟需开展起新生儿血清UB检测方法的研究及实践。研究目的1.探索POD检测新生儿血清UB水平的方法学。2.探讨血清UB的测定在新生儿黄疸管理中的初步临床应用价值。研究方法1.通过探讨不同浓度辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)、不同浓度胆红素标准品溶液条件对一级速率常数Kp标准化的影响,不同-20℃冻存时长对HRP活性的影响,探讨不同胆红素/白蛋白摩尔比(bilirubinto albumin molar ratio,BAMR)、不同酸碱度(Pondus Hydrogenii,pH)的胆红素标准血清的UB变化,逐步过渡到新生儿血清UB的检测,以验证POD法检测血清UB的精密度、稳定性。2.选取2021年9月至2022年12月期间深圳市妇幼保健院新生儿科收治的胎龄≥35周的新生儿黄疸患儿共60例,用POD法检测入院时未接受光疗前的血清UB水平,分析入组病例的临床资料与血清UB水平的相关性;根据脑干听觉诱发电位(brainstem auditory evoked potentials,BAEP)检查结果将纳入病例分为正常组和异常组,分析组间差异,建立UB与异常BAEP的logistic回归模型,绘制ROC曲线评估UB对胆红素所致听力损伤的预测效能。研究结果1.方法学部分1.1在pH 7.4,反应温度37.0℃且避光条件下,不同胆红素标准品溶液浓度(1、2、3μmol/L)、不同 HRP 浓度(0.019、0.038、0.075 μg/mL)对一级速率常数Kp无显著影响。1.2在pH 7.4,反应温度37.0℃且避光条件下,胆红素标准血清的UB水平随着BAMR(范围0.1～2.0)增大而显著升高。1.3在反应温度37.0℃且避光条件下,固定BAMR胆红素标准血清在pH(7.0-7.6)的范围内UB水平无显著差异,而在pH=6.8和pH=8.0的条件下UB出现相应的显著升高和降低。1.4 HRP活性和新生儿血清样品的UB水平分别于-20℃冻存3周和1周内无明显下降。1.5通过POD法检测不同BAMR的胆红素标准血清和新生儿血清UB水平具有良好的精密度,平均批内变异系数小于10%,平均批间变异系数小于15%。2.临床研究部分2.1新生儿血清UB水平与血清总胆红素(total serum bilirubin,TSB)、BAMR呈显著正相关,随着DB/TSB 比值的增加,斜率增大,R2减小。2.2胎龄35～37周的早产儿与足月儿、不同性别、不同pH组别的血清UB的总体水平无显著差异。2.3 BAEP异常组(n=6)的TSB、BAMR、UB水平均显著高于BAEP正常组(n=54);Logistic回归显示,UB、TSB、BAMR均与异常BAEP结局显著相关(P0.05),其中以UB的准确性最佳,UB的ROC曲线下面积(0.961,P0.001),大于另两者的AUC;在最佳截断点UB≥24.1 nmol/L(或1.4 μg/dL)时,灵敏度为83.3%,特异度为94.4%。研究结论1.本研究建立了 POD检测新生儿血清游离胆红素的方法,并应用于胎龄≥35周的新生儿黄疸患儿临床血清样品的检测,该法操作简便、快速定量且经济可行,具有良好的精密度,便于临床开展。2.血清UB水平对胆红素所致听力损伤有一定的预测价值,可作为早期监测的指标,对新生儿黄疸管理有一定的指导意义。