BRD4调控实验性蛛网膜下腔出血后神经元细胞自噬依赖性铁死亡的机制研究

作     者：卢鹏 

作者单位：西南医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：江涌

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：蛛网膜下腔出血 预后因素 BRD4蛋白 神经元 自噬依赖性铁死亡 

摘      要：目的:蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage,SAH)是一种具有高死亡率和高致残率的出血性脑血管疾病。SAH后早期脑损伤(Early brain injury,EBI)与SAH后的不良预后相关。神经元死亡是EBI导致患者预后差的关键因素。铁死亡(ferroptosis)是一种新型的调控性细胞死亡方式,研究发现在SAH模型中,EBI中有铁死亡的存在。BRD4是溴结构域和超末端结构域(BET)家族中最重要的蛋白,其主要功能是调节炎症和氧化应激。文献证实在小鼠缺血性脑卒中模型中,使用药物抑制BRD4表达,减轻促炎因子和趋化因子的表达,增加抗氧化能力,对脑组织具有神经保护作用。但BRD4在蛛网膜下腔出血后EBI中还未有相关报道,且同时BRD4与铁死亡的作用仍未被详细探讨。在这项研究中,我们旨在探索BRD4在实验性SAH后神经元中调控铁死亡的作用和潜在机制。实验方法:1.小鼠实验:运用改良单夹穿刺法构建实验小鼠SAH模型。运用蛋白质免疫印迹法(Western Blot,WB)探索SAH后EBI期间脑组织内源性BRD4蛋白表达水平。免疫荧光(Immunofluorescence,IF)用于观察其在神经细胞中的定位。使用改良加西亚量表(Modified Garcia scale)和平衡木试验(Beam balance tests)对小鼠神经功能进行评估。2.细胞实验:使用氧合血红蛋白(Oxyhemoglobin,OxyHb)刺激HT22小鼠海马神经元细胞模拟体外SAH损伤。2.1对照组(control)和实验组(OxyHb组),使用WB、CCK8、细胞荧光、MDA检测试剂盒等试方法检测铁死亡相关指标。2.2使用商品化慢病毒构建HT22神经元细胞内BRD4敲减稳定株。OxyHb刺激细胞分组对照组(HT22-NC、HT22-KD)和实验组(OxyHbHT22-NC、OxyHb-HT22-KD)。通过上述方法检测RBD4沉默后铁死亡相关指标的变化。结果:1.小鼠脑组织皮层中BRD4与神经元共定位;免疫荧光显示SAH后皮层神经元内的BRD4表达下降。***刺激诱导HT22发生铁死亡:OxyHb刺激下CCK8提示细胞活力下降;细胞内铁积累;活性氧ROS指标升高;脂质过氧化指标MDA/BODIPY 581/591 C11显著上升;透射电镜显示线粒体致密变小,线粒体外膜显著增厚;Western blot显示抗氧化关键蛋白GPX4、Co Q10B蛋白显著下降以及BRD4表达下降。***-1抑制OxyHb诱导的HT22铁死亡:Fer-1 6 u M是发挥最大抑制效果的最低浓度;Fer-1 6 u M可以挽救OxyHb刺激诱导的细胞活力下降;减少细胞死亡数量,提高细胞生长密度;显著降低OxyHb诱导升高的脂质过氧化物指标MDA/BODIPY 581/591 C11;增加抗氧化蛋白GPX4的表达。***4敲减促进OxyHb诱导的HT22铁死亡:神经元细胞使用慢病毒感染获取敲减效果满意的细胞株;BRD4敲减和OxyHb刺激均会导致细胞活力下降,活性氧ROS水平显著升高;脂质过氧化物指MDA/BODIPY581/591 C11显著升高;抗铁死亡关键蛋白GPX4表达下降,相较于OxyHb-HT22-NC组,OxyHb-HT22-KD组上述所有指标变化更明显,并具有统计学差异。***4的抑制促进铁蛋白自噬相关性铁死亡:BRD4敲减后导致细胞内铁积累,细胞内亚铁与溶酶体共定位;FTH1蛋白表达显著降低,NCOA4表达增加,且自噬相关蛋白SQSTM1/p62表达降低,表明铁蛋白自噬过程增加;自噬相关基因(LC3B、ATG4D、ATG16L、ATG101)表达增加。结论:本研究发现:***诱导皮层神经元内BRD4表达下降;***4的抑制促进神经元铁蛋白自噬依赖性铁死亡。结果表明神经元内源性BRD4参与神经元的铁死亡过程。