靶向鉴定FLCN互作蛋白的TurboID邻近蛋白标记系统的建立与评价

作     者：马世程 

作者单位：东华大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李凯;张云龙;张锐

授予年度：2023年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100104[医学-病理学与病理生理学] 10[医学] 

主      题：FLCN TurboID 免疫共沉淀 EEF2 DDX3X 

摘      要：卵泡素Folliculin(FLCN)是一种肿瘤抑制基因,研究表明其缺失或突变可导致Birt-Hogg-Dubé(BHD)综合征,此综合征会导致肾脏、皮肤和肺出现多囊瘤等症状。TurboID是一种高效介导内源蛋白生物素化的生物素邻近蛋白标记技术,基于Bio ID技术优化建立,借助生物素酶Bir A仅需添加外源生物素即可启动标记,具有操作简便且对细胞无毒性的优点。为了探究FLCN未知功能,本研究借助TurboID技术联合质谱鉴定的方法,从筛查FLCN互作蛋白网络获取更多线索。首先构建了TurboID-FLCN邻近蛋白标记系统,设计不同生物素添加时间梯度,优选最佳标记时间,细胞裂解液采用链霉亲和素亲和介质纯化生物素标记的FLCN邻近蛋白,经过SDS-PAGE分离及Western blot鉴定后,将纯化的生物素化蛋白样品进行LC-MS/MS鉴定及生物信息学分析筛选,最后对筛选出来的感兴趣的FLCN候选互作蛋白进行免疫共沉淀(Co-IP)和细胞免疫荧光实验来验证蛋白质相互作用关系。结果表明,我们在HEK293T细胞中成功构建并实现了TurboID-FLCN邻近蛋白标记系统的运转,确定了4 h为该系统的最佳生物素标记时间,质谱鉴定结果显示在4h生物素标记时间下TurboID-FLCN组和Control组生物素化蛋白种类分别为1483种和496种,其中属于FLCN互作蛋白的蛋白数目分别为31和13。通过TurboID-FLCN组与对照组比较,去除背景蛋白并根据鉴定结果中蛋白的特异性肽段数差异进行筛选后,在TurboID-FLCN组中鉴定出33个独特的相互作用蛋白。进一步的GO和KEGG信号通路富集分析结果显示,在GO富集细胞组成分析中,TurboID-FLCN组蛋白在细胞质、核、核仁、核染色体、核糖体、剪接体复合物等显著富集;在分子功能分析中,包括RNA结合、ATP结合、蛋白结合、核苷酸结合、m RNA结合、RNA解旋酶活性、ATPase活性等功能;生物进程方面,蛋白在翻译、病毒转录、m RNA分解代谢、m RNA剪接与加工及蛋白质运输等显著聚集;KEGG富集分析揭示了核糖体与核糖体生物发生、RNA转运、剪接体,蛋白输出、DNA复制等信号通路。结合GO分析我们发现在33个独特蛋白中,DDX3X与FLCN在核、微管组织中心、细胞骨架、中心体等多处聚集且行使蛋白结合功能参与诸多生物进程。而结合KEGG分析则发现EEF2富集于AMPK信号通路,这对于挖掘FLCN在AMPK信号通路上的分子机制有重大意义。于是我们综合选取DDX3X、EEF2两个为FLCN候选互作蛋白,使用Co-IP实验及免疫荧光实验成功验证了两者与FLCN的相互作用。本研究进一步证实TurboID可作为有效的邻近蛋白标记技术,在探究FLCN互作蛋白方向上起到关键作用。此外,筛选发现的两个FLCN互作蛋白,EEF2与DDX3X对未来进一步探究FLCN基因的功能,包括其参与的调控网络等提供了重要线索。基于此研究推测:(1)FLCN通过与EEF2相互作用来激活EEF2K,使EEF2磷酸化而失活,进而降低了肿瘤细胞过度增殖期间蛋白质的翻译合成,最终起到抑癌作用;(2)FLCN与DDX3X发生互作后,抑制其激活致癌因子β-catenin的能力进而抑制肿瘤的发生。这将在课题组后续研究中进一步验证。