锌铁转运蛋白基因和GsIRT3和GsZIP15在碱胁迫下的功能研究

作     者：王海航 

作者单位：哈尔滨师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：金晓霞

授予年度：2023年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

主      题：锌铁转运蛋白 野生大豆 碱胁迫 GsIRT3 GsZIP15 

摘      要：土壤的盐碱化使得植物正常生理活动受到阻碍,极大的破坏了农作植物的生产供应,使国家农业生产和进出口利润损失惨重。野生大豆(Glycine soja L.)因其独有的生长环境具有较强的抗逆特性,可作为挖掘耐盐碱关键基因的理想供体。本研究以G07256野生大豆为试验材料,克隆获得了GsIRT3和GsZIP15基因,并构建p CAMBIA1300-GsIRT3和p CAMBIA1300-GsZIP15过表达载体,利用碱处理野生大豆分析GsIRT3和GsZIP15基因的表达模式;对GsZIP15的拟南芥过表达、突变体株系和GsIRT3拟南芥过表达株系进行了碱、盐、缺铁及ABA等胁迫处理,通过对表观形态指标、生理活性及已知的逆境胁迫响应相关Marker基因表达特性的分析,确定了GsIRT3和GsZIP15在碱、盐、缺铁及ABA处理下所发挥的功能;进一步通过发根农杆菌K599介导的大豆毛状根转化技术,获得携带目的基因的转基因大豆毛状根,并对其在碱胁迫下的表观形态指标、生理指标进行研究,验证了GsIRT3和GsZIP15基因转大豆毛状根在碱胁迫下的功能。本实验所得出的主要研究结果如下:(1)成功克隆野生大豆锌铁转运蛋白基因GsIRT3和GsZIP15基因,该基因编码区全长为1 473 bp和1 122 bp,将目的基因片段融合到p CAMBIA1300-flag表达载体上,构建重组表达载体。(2)荧光定量PCR结果显示,GsIRT3和GsZIP15基因在野生大豆的不同组织中均有不同程度的表达。GsIRT3在野生大豆成熟茎中表达量最高,在幼嫩茎中表达量最低。GsZIP15在主根中表达量最高,在幼嫩叶片中的表达量最低。对碱胁迫下GsIRT3和GsZIP15基因表达模式分析发现,GsIRT3和GsZIP15基因很可能参与调控植物响应非生物胁迫,调节植物的生长发育。(3)成功构建了p YES2-GsIRT3和p YES2-GsZIP15酵母表达载体,并转入酿酒酵母DY1454、DEY1455、ZHY3感受态细胞中,分别对p YES2-GsIRT3和p YES2-GsZIP15进行非生物胁迫处理。发现重组酵母p YES2-GsIRT3和p YES2-GsZIP15对金属铁胁迫、锌胁迫都有较强耐受力。表明p YES2-GsIRT3和p YES2-GsZIP15基因可以提高转基因酵母的抵抗金属离子胁迫的能力,并且提髙转基因酵母的逆境胁迫后的成活能力。(4)通过花序侵染法获得了GsIRT3和GsZIP15过表达转基因拟南芥,对野生型拟南芥WT和GsIRT3和GsZIP15过表达、突变体转基因拟南芥幼苗进行不同胁迫处理,结果表明,与WT相比,幼苗期GsIRT3和GsZIP15过表达转基因拟南芥耐受性增强,GsZIP15突变体株系敏感性增强。为了进一步探究GsIRT3和GsZIP15在转录水平上的作用机制,研究WT和GsIRT3和GsZIP15过表达转基因拟南芥中盐碱、缺铁等胁迫相关Marker基因的表达模式,结果表明逆境胁迫标记基因在GsZIP15和过表达转基因拟南芥中多为上调表达,且表达量高于显著WT,说明GsIRT3和GsZIP15基因可能通过调节Marker基因的表达水平来增强植物对盐、碱、干旱胁迫的耐受性。(5)发根农杆菌K599介导基因转化大豆毛状根,通过测量根长、鲜重和MDA及脯氨酸含量验证GsIRT3和GsZIP15基因转大豆毛状根增强了大豆对碱的耐受性。