玉米大斑病菌丝氨酸棕榈酰转移酶StLCB1和StLCB2对致病性的调控作用
作者单位：河北农业大学
学位级别：硕士
导师姓名：郝志敏
授予年度：2023年
学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学]
摘 要：玉米大斑病(Northern Corn Leaf Blight)是玉米上最主要的叶斑病之一,常造成玉米严重减产,导致经济上的重大损失。病害传播过程中,玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)主要依靠分生孢子粘附于寄主叶片表皮,萌发产生芽管后,其末端膨大形成附着胞。附着胞内不断积累膨压,并分泌胞壁降解酶,最终形成侵入钉,在机械压力作用下穿透寄主表皮,完成侵染过程。鞘脂是真核细胞的基本成分,其代谢产物赋予膜重要的结构特性,也是多种细胞过程的调节分子。鞘氨醇(Sphingosine,Sph)是鞘脂代谢途径的关键中间产物,由丝氨酸棕榈酰转移酶(Serine palmitoyl transferase,SPT)催化合成,SPT也是该合成途径的限速酶。本课题组前期发现,丝氨酸棕榈酰转移酶特异性抑制剂多球壳菌素(Myriocin)处理可引起大斑病菌附着胞发育异常。本研究获得了病菌附着胞形成过程中的代谢组数据,发现在附着胞形成时期鞘氨醇含量显著上升。因此,利用鞘氨醇激酶特异性抑制剂SKI Ⅱ处理以增加鞘氨醇的积累,并创制了限速酶SPT催化亚基LCB1的过表达突变体和LCB2的RNAi突变体,对鞘脂与大斑病菌致病性调控的关系进行研究。主要研究成果如下:1.在JGI公布的玉米大斑病菌基因组数据中搜索到ID为167454的LCB1编码基因,命名为StLCB1。该基因全长3987bp,CDS序列大小为1527 bp,编码509个氨基酸;ID为73160的LCB2编码基因,命名为StLCB2。其全长为3974bp,CDS序列大小为1974bp,编码658个氨基酸。2.鞘氨醇激酶抑制剂(SKI Ⅱ)处理病菌分生孢子,结果表明,在分生孢子发育的第6h时,附着胞的形成率在一定范围内随着抑制剂浓度的增加而增加,浓度过高反而抑制附着胞的发育。在500μmol/L SKI Ⅱ的作用下效果最好,附着胞形成率为93.2%,均高于对照组的75.5%。在致病性试验中,实验组的早期侵染点数为353高于对照组的侵染点数182。说明鞘氨醇和鞘氨醇-1-磷酸之间的平衡对分生孢子侵染结构的发育有重要的影响。3.通过PEG介导的原生质体转化技术,将StLCB1过表达和StLCB2沉默载体分别转化玉米大斑病菌野生型菌株01-23,经过潮霉素B抗性筛选、PCR、qRT-PCR和Western-blot验证,获得2株3HA::eGFP::StLCB1超表达突变体,命名为pBARKS1-StLCB1-1和pBARKS1-StLCB1-2。经过潮霉素B抗性筛选、PCR、半定量RT-PCR、qRT-PCR验证,获得3株StLCB2沉默突变体,分别命名为RNI-StLCB2-1、RNI-StLCB2-30 和 RNI-StLCB2-49。qRT-PCR 分析表明,pBARKS1-StLCB1突变体中StLCB1的表达量分别为WT的3.1和4.3倍。RNI-StLCB2沉默突变体中StLCB2的表达量分别为WT的0.51,0.35和0.47倍。4.与WT菌株相比,StLCB1过表达突变体的气生菌丝致密,菌落黑褐色,胞内黑色素含量是WT的1.39倍;胞外黑色素含量是WT的1.34倍。菌丝隔膜平均间距是WT的1.71倍;StLCB2沉默突变体气生菌丝细长致密,呈毡状,菌落呈现灰白色,胞内黑色素含量是WT的0.18倍;胞外黑色素含量是WT的0.35倍左右。几乎不产生分生孢子,菌丝隔膜平均间距是WT的4倍左右,且生长速度减缓。说明StLCB1和StLCB2基因可以调控大斑病菌的菌丝生长和分生孢子发育。5.通过玻璃纸诱导,观察附着胞形成、穿透情况,并利用感病寄主检测其致病性。结果表明,在诱导第24h时,StLCB1过表达突变体附着胞形成率为51.3%,高于WT附着胞形成率30.2%,在诱导第48h时,穿透率为30.1%低于WT的66.4%;StLCB2沉默突变体在诱导24h时,菌丝末端膨大率仅为3.86%,在诱导第48h时,其穿透率为6.72%,均远远低于WT。在感病寄主B73玉米自交系上,接种了StLCB1过表达和StLCB2沉默突变体的玉米叶片早期侵染点数分别为137和37,均低于接种WT的侵染点数253个;接种12d后,玉米叶片上均出现黄褐色坏死状病斑,突变体的叶片发病面积较小,尤其是StLCB2沉默突变体。说明StLCB1和StLCB2基因在调控附着胞发育和致病性方面发挥了重要作用。6.对突变体和WT的鞘氨醇含量进行测定,结果发现StLCB1突变体的鞘氨醇含量相比WT略有升高,但不明显;StLCB2沉默突变体的鞘氨醇含量下降至WT的0.79倍。qRT-PCR检测发现,在StLCB1超表达突变体中,StLCB2基因的表达量没有明显变化;在StLCB2沉默突变体中,StLCB1基因的表达量下降至WT的0.65倍。说明StLCB1和StLCB2并不存在功能冗余,而是相互影响,协同调控鞘氨醇的合成。7.利用PI(碘化丙啶)染色,对突变体细胞膜完整性进行分析。结果显示WT和StLCB1超表达突变体只有断裂的菌丝末端有红色荧光,细胞核几乎没有着色现象,说明StLCB1超表达突变体细胞膜完整性良好;而StLCB2沉默突变体细胞几乎都显示出红色荧光,说明StLCB2的沉默引起细胞膜的完整性受损。本研究以侵染结构形态发生调控机制为切入点,对病菌侵染中鞘氨醇的作用进行了深入研究,明确了鞘氨醇对玉米大斑病菌附着胞的形成、菌丝极性生长、细胞膜完整性和致病性能力的调控作用,为挖掘新的病害防控策略奠定了基础。
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