EjFAD8对调控枇杷脂质代谢以及抗寒性的研究

作     者：徐勋 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郭启高;陈本文

授予年度：2023年

学科分类：09[农学] 0902[农学-园艺学] 090201[农学-果树学] 

主      题：低温胁迫 三倍体枇杷 EjFAD8 抗寒性 脂质变化 

摘      要：枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)是原产于中国西南部的常绿果树,在中国已经有2200多年的栽培历史。枇杷果实酸甜多汁,富有营养,具有很高的商业价值。枇杷原产于湿热的亚热带地区,其生长发育受到气候环境的影响,对低温非常敏感。枇杷与其他果树的不同之处在于其物候期为一般秋冬季节开花坐果,所以其花和幼果的发育就极易受到低温胁迫的影响,从而导致产量的降低。因此,选育出耐寒的枇杷品种是枇杷育种的重要目标之一。在前期的研究中,发现四倍体枇杷(B431)与二倍体野生枇杷(GZ23)杂交获得的F1代三倍体枇杷,比其亲本更耐低温且具有更高的光合效率。本研究通过对转录组和脂质组数据的分析发现,脂肪酸去饱和酶基因Ej FAD8与枇杷低温密切相关。进而采用q PCR分析了Ej FAD8在不同倍性枇杷中的表达水平,证明了Ej FAD8在低温下是显著上调的,尤其是三倍体枇杷中最为显著。随后通过克隆Ej FAD8,构建植物表达载体将其转入拟南芥中;并且构建TRV载体将其转入枇杷幼苗中,进一步分析Ej FAD8的基因功能。主要研究结果如下:1.不同倍性枇杷在低温胁迫下的转录组和脂质组分析:为了明确三倍体杂种枇杷抗寒性高于其亲本的原因,我们分析了不同倍性枇杷在处理前后的转录组和脂质组数据。转录组数据说明,在脂质代谢的一系列基因中,Ej FAD8在三倍体枇杷中上调最为显著,明显高于二倍体和四倍体枇杷;脂质组数据分析表明,与Ej FAD8相关的脂质在三倍体枇杷中明显上调。可见,Ej FAD8在三倍体杂种枇杷的耐寒中起重要作用。*** FAD8的克隆、生物信息学分析和亚细胞定位:Ej FAD8在枇杷基因组中被注释为脂肪酸去饱和酶基因,并从三倍体枇杷叶的c DNA中扩增出1155 bp片段。序列比对和系统发育树分析表明Ej FAD8与蔷薇科白梨(Pyrus bretschneideri)中的Pb FAD8和苹果(Malus domestica)中的Md FAD8具有较高同源性。亚细胞定位显示Ej FAD8的荧光信号存在于叶绿体中,这表明Ej FAD8是一种叶绿体定位的蛋白。3.异源过表达Ej FAD8对拟南芥抗寒性的影响:异源过表达Ej FAD8基因的拟南芥出现了植株矮化的表型,且在低温处理下,与野生型相比,过表达植株并没有出现明显的萎蔫与叶片脱水,并在恢复正常温度3天后又恢复了正常生长;在低温下,转基因植株的根系也明显长于野生型拟南芥。对生理数据的测量表明,低温下转基因植株的相对电导率低于野生型,且叶片的叶绿素含量高于野生型;用NBT和DAB对低温处理下的叶片染色表明,超表达植株的活性氧含量更低;用q PCR对低温处理前后的拟南芥进行定量分析也可以看出,低温下转基因株系抗寒相关的以及促进脂质不饱和代谢的基因表达量相对野生型都有显著的上调;脂质数据也说明Ej FAD8超表达的拟南芥叶片不饱和脂肪酸含量较野生型高,从而提高了拟南芥的耐寒性;对Ej FAD8的启动子分析表明了Ej FAD8启动子具有许多与激素相关的结合元件,通过脱落酸对拟南芥的处理也可以看出Ej FAD8转基因拟南芥更能适应具有脱落酸的环境。***抑制Ej FAD8表达对枇杷的影响:构建TRV载体并注射进枇杷幼苗的子叶中,对其进行q PCR分析,证明VIGS基因沉默枇杷株系中Ej FAD8基因表达被抑制。随后将其与阴性对照一起进行低温处理,将处理前后的枇杷叶片进行转录组学测序。结果显示VIGS基因沉默枇杷株系与对照相比,显示出更多的基因在低温下下调,且更多基因富集在环境应激响应中。