营养胁迫条件下成团泛菌存活关键基因分析

作     者：肖嘉文 

作者单位：河北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张冬冬

授予年度：2023年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 

主      题：成团泛菌 转座子测序 基因组测序 营养胁迫 存活 

摘      要：成团泛菌(Pantoea agglomerans)是泛菌属(Pantoea),革兰氏阴性细菌,在自然界分布广泛,作为病原体可以引起多种植物病害。成团泛菌CHTF15菌株是从感染黑斑病的核桃叶部病变组织中分离获得,经回接试验表明该菌株对植物叶片有较强的侵染能力。菌体定殖在植物叶面后,可以从气孔或伤痕侵入从而引起叶部病变,进而引起核桃叶面和果实的坏死。植物叶部表面营养物质相对匮乏,因此在侵染植株叶面过程中,菌体的繁殖受到了营养胁迫。研究营养胁迫条件下成团泛菌存活的关键基因,将有助于深入理解成团泛菌的致病机理以及该病原菌引起的病害防治。本试验采用二代测序平台和三代测序平台对成团泛菌CHTF15菌株进行全基因组测序,获得了该菌株的全基因组完成图谱。基因组大小为4 820 607 bp,其中包含1个染色体和3个质粒,基因组中包含有4 336个CDS,22个rRNA,75个tRNA。通过数据库比对,对CHTF15的全基因组进行了注释,对其致病性和毒力因子进行了分析,该菌株能产生Colibactin蛋白和血溶素等多种毒素并通过VI分泌系统注入宿主细胞中,引发多种植物病害。转座子插入测序(Tn-seq)是一种将高通量测序与转座子构建随机突变体文库相结合,从而对细菌基因组进行分析的技术。利用Mariner转座子构建CHTF15菌株随机突变文库。绘制CHTF15菌株在不同稀释倍数YEP液体培养基的生长曲线,确定在0.1%YEP液体培养基中CHTF15菌株的生长繁殖受到营养物质浓度的限制,以该条件作为营养胁迫处理条件。营养胁迫条件下对CHTF15菌株随机突变文库进行处理,运用Tn-seq技术分析营养胁迫条件下的必需基因,最终找到了 105个基因是营养胁迫条件下CHTF15菌株所必需,根据文库差异绘制火山图(log2FC≤-1和P-value≤0.05)筛选获得15个显著差异基因。105个基因在COG(Clusters of Orthologous Groups)分类中涉及能量产生和转换,氨基酸的转运和代谢,细胞内运输、分泌和囊泡运输,辅酶转运和代谢,转录、翻译后修饰,蛋白质周转、伴侣,碳水化合物运输与代谢,DNA复制重组和修复等生物活动。富集分析和显著基因的代谢注释表明,营养胁迫条件下,蛋白质的合成过程如二硫键的形成、氨基酸的运输,碳代谢过程的三羧酸循环和磷酸戊糖途径均对细菌的存活有着重要意义。同时在营养胁迫条件下会促进过氧化物的积累造成DNA的损伤,需要依靠RecA的同源重组系统进行修复。15个差异显著基因注释主要包括氨基酸或蛋白质的合成及代谢、核酸代谢和重组修复等3类。选取epmA、dksA、ribB、xerD等4个基因进行敲除验证,构建了相应的基因缺失突变菌株。其中epmA基因与蛋白质的翻译相关,dksA与蛋白质二硫键的形成相关,ribB基因是核糖进入核黄素合成代谢的关键,而xerD基因与重组修复相中分解染色体二聚体相关。将关键基因缺失突变株与野生型菌株分别在0.1%YEP和核桃叶片表面进行共培养,其在0.1%YEP中的竞争指数分别为0.064、0.120、0.078、0.105,在核桃叶面的竞争指数分别为0.087、0.091、0.075、0.091。突变菌株在营养胁迫条件下的生存能力较野生菌株明显下降,表明筛选的基因为成团泛菌在营养胁迫条件下的必需基因。本研究为明确成团泛菌叶面存活机制和病原菌侵染过程奠定基础。