井冈霉素抑制伏马毒素合成的作用机制

作     者：周璐祺 

作者单位：河北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵斌

授予年度：2023年

学科分类：090403[农学-农药学(可授农学、理学学位）] 09[农学] 0904[农学-植物保护] 

主      题：拟轮枝镰孢 伏马毒素 井冈霉素 海藻糖酶 

摘      要：拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)是造成玉米穗腐病的主要致病菌之一,对玉米种植造成巨大的经济和生产损失。除了严重影响玉米的产量还会产生次生代谢产物——伏马毒素,对谷物造成污染引起人畜的疾病。目前常用的防治玉米穗腐病的主要手段为玉米抗性植株和化学药剂防治,但是一些化学药剂在控制病害发生的同时并不能有效抑制伏马毒素的合成,甚至会刺激伏马毒素的合成。井冈霉素是我国自主研发的生物源抗生素,能够在β-D-糖苷酶的作用下生成井岗羟胺,抑制海藻糖酶活性。本试验前期通过田间试验意外发现井冈霉素在控制玉米大斑病、玉米纹枯病的同时还能降低伏马毒素污染水平,但是其毒素阻控机制尚不明确。因此本试验主要围绕井冈霉素阻控伏马毒素合成的分子机理展开研究,主要包括以下3个方面。1.首先在室内验证了不同浓度井冈霉素处理下伏马毒素的合成能力,发现井冈霉素可以稳定抑制伏马毒素的合成。采用菌丝生长速率法观察井冈霉素对拟轮枝镰孢的抑制作用,并未发现其对拟轮枝镰孢菌丝生长的明显抑制作用,但能抑制孢子萌发;利用透射电镜进一步观察了药剂处理后的拟轮枝镰孢的亚细胞结构,发现病菌线粒体结构被破坏,继而通过ATP酶活性测定对这一现象进行了验证。同时测定伏马毒素合成相关的FUM家族基因表达量呈下降表达趋势与伏马毒素合成结果一致,证明井冈霉素可以通过对伏马毒素的合成基因簇的调控抑制毒素合成。2.利用生物物理学和3D打印技术确定了井冈霉素候选作用靶标,其中包括海藻糖酶、β-葡萄糖苷酶、ATP依赖性丝氨酸蛋白酶、热休克蛋白等11种候选靶标蛋白;本项目聚焦于候选作用靶标海藻糖酶在伏马毒素合成过程中的作用,以拟轮枝镰孢野生型菌株为出发菌株构建了海藻糖酶的缺失突变体,通过伏马毒素合成量及FUM家族基因表达分析,发现海藻糖酶与拟轮枝镰孢生长、致病力和伏马毒素合成能力正相关;研究进而测定了野生型菌株和突变体菌株中葡萄糖含量、丙酮酸含量、ATP酶活性,发现突变体中上述指标与井冈霉素处理后趋于一致。3.利用计算化学技术对拟轮枝镰孢与海藻糖酶的互作能力进行了验证,通过分子对接分析了井冈霉素与海藻糖酶的结合活性并鉴定了主要结合位点ASP286、TRP285、ASN322、GLY450、GLN333、ASP452、GLN606、GLN398、TYR28、ARG447、LYS190,通过计算机点突变确定这些突变位点在受体与配体结合中具有重要作用。TRP285、ASP286、GLN606为主要作用氨基酸,这些氨基酸突变后其相互作用能力降低。综上所述,井冈霉素通过抑制拟轮枝镰孢中海藻糖酶的活性调控病菌生长发育、致病力和伏马毒素合成。该结果揭示了井冈霉素抑制伏马毒素合成的作用机制,为合理施用化学药剂防控伏马毒素的污染提供指导。