非RBD突变远程增强N501Y介导SARS-CoV-2跨种传播小鼠

作     者：朱一超 

作者单位：军事科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：孙强

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：新型冠状病毒 刺突蛋白 鼠适应株 奥密克戎 

摘      要：研究背景:新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-Co V-2)传播已近三年,对人民生命财产和健康带来严重威胁,对世界经济造成巨大损失。截至2023年3月7日,全球确诊超7.5亿,死亡超686万例。SARS-Co V-2具有广泛的宿主嗜性,在动物感染方面,SARS-Co V-2不仅可在水貂、仓鼠、白尾鹿物种内部进行传播,还可以通过动物回传给人。因此国内外对SARS-Co V-2动物感染性关注密切。小鼠是许多传染病的传播载体,例如鼠疫,流行性出血热等。而且小鼠存在面广且难以控制,在卫生条件差的地区更是如此,如果SARS-Co V-2可以在小鼠间传播,并可以回传给人,那将会造成灾难性的影响。研究已表明SARS-Co V-2刺突蛋白(Spike protein,S)上的N501Y突变可打破跨种传播障碍,使SARS-Co V-2在实验室小鼠中建立有效的感染。这一形势下,研究自然突变中有哪些突变位点可以造成SARS-Co V-2向小鼠跨种传播以及突变位点造成SARS-Co V-2向小鼠跨种传播的可能机制具有重要意义。除此之外,通过SARS-Co V-2流行株,如奥密克戎(Omicron)突变株,对解析的突变位点在SARS-Co V-2流行株对小鼠的感染性中的作用进行验证,从而对SARS-Co V-2流行株的跨种传播风险进行预警。研究目的:随着新冠持续流行,SARS-Co V-2基因组所产生突变越来越多,其中某些突变会增强SARS-Co V-2跨物种传播能力,使中间宿主成为新的传播源头,导致疫情有再次爆发的风险。研究已表明N501Y突变可以介导SARS-Co V-2感染小鼠,且受体结合域(Receptor binding domain,RBD)内部的突变对N501Y介导SARS-Co V-2跨种传播到小鼠的能力具有增强作用,但RBD外突变是否也具有此功能尚不清楚,因此本研究拟探索非RBD突变对N501Y介导SARS-Co V-2跨种传播到小鼠的能力的影响及相关机制。研究方法:1.筛选SARS-Co V-2向小鼠跨物种传播突变位点:目前存在人为将SARSCo V-2野生株在小鼠体内连续传代进行驯化得到的鼠适应株,通过反向遗传学技术获得的鼠适应株以及SARS-Co V-2野生株自然突变后鉴定得到的鼠适应株,通过文献调研比较分析SARS-Co V-2鼠适应株上存在的突变,筛选潜在的介导SARS-Co V-2向小鼠跨物种传播的突变位点。***-Co V-2感染性分析:(1)S蛋白表达载体的构建:通过限制性内切酶酶切,点突变,同源重组等分子生物学方法构建SARS-Co V-2鼠适应株及其相关突变的S蛋白表达载体,通过测序挑选出正确的目的质粒。(2)感染性分析:通过转染试剂将SARS-Co V-2鼠适应株及其相关突变的S蛋白表达载体转染至稳定表达人血管紧张素转化酶2(human angiotensin converting enzyme 2,h ACE2)的293T细胞(293T-h ACE2)和稳定表达小鼠ACE2(mouse angiotensin converting enzyme 2,m ACE2)的293T细胞(293T-m ACE2)中,以野生型SARS-Co V-2 S蛋白作为对照,通过统计合胞体形成率比较SARS-Co V-2鼠适应株及其相关突变S蛋白介导细胞融合的能力,利用蛋白免疫印迹(Western bolt,WB)检测S2亚基,利用免疫沉淀法(Immunoprecipitation,IP)检测S蛋白与受体结合能力,利用逆转录病毒三质粒系统包装SARS-Co V-2鼠适应株及其相关突变体的假病毒,感染细胞后利用萤火虫荧光素酶报告基因检测来评估感染水平。***-Co V-2跨物种传播机制解析:S蛋白是SARS-Co V-2入侵宿主细胞的关键蛋白,S蛋白突变后其与受体ACE2的相互作用会发生改变。用已解析的SARS-Co V-2 S蛋白结构为模板利用SWISS-MODEL的三维算法进行三维建模,并在三维结构上分析病毒突变对病毒传播能力的影响。***-Co V-2流行株验证:挑选与解析的突变位点相关的SARS-Co V-2流行株进行验证,通过限制性内切酶酶切,点突变,同源重组等分子生物学手段获得SARS-Co V-2流行株S蛋白表达载体,通过测序挑选出正确的目的质粒。对需验证的突变位点进行回复突变,通过合胞体形成实验检测膜融合能力变化,通过假病毒感染实验评估感染性变化,从而对SARS-Co V-2流行株是否具有向小鼠跨种传播的风险提供理论支撑并进行预警。研究结果:1.通过文献调研比较分析SARS-Co V-2鼠适应株突变位点,筛选分析得到一