lncRNA U90926编码短肽调控巨噬细胞极化在病毒性心肌炎中的作用及机制研究

作     者：殷国泉 

作者单位：皖南医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：吕坤

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：病毒性心肌炎 编码短肽 长链非编码RNA 巨噬细胞极化 

摘      要：目的:筛选并鉴定具有短肽编码能力的巨噬细胞极化相关lncRNAs;明确lncRNA(long non-coding RNA,lncRNA)U90926及其编码的短肽MPM-87(Macrophage polarization micropeptide-87aa,MPM-87)在巨噬细胞极化过程中的功能,阐明MPM-87调控巨噬细胞极化在病毒性心肌炎中的作用机制。方法:利用生物信息学技术对巨噬细胞中差异表达的lncRNAs进行小开放阅读框s ORF(small open reading frames,s ORF)的鉴定和编码潜能的预测;构建融合表达质粒ORF-GFPmut(start codon-mutated GFP,GFPmut)并转染HEK293T细胞,应用高内涵筛选(high content screening,HCS)技术检测转染细胞中GFP荧光的表达,筛选具有编码潜能的lncRNAs。根据筛选结果,初步锁定其中编码潜能较高的lncRNA U90926做下一步的功能探讨。使用q RT-PCR检测lncRNA U90926分子在巨噬细胞极化过程中的表达和功能;构建CVB3诱导的病毒性心肌炎小鼠模型,检测lncRNA U90926分子在心肌炎小鼠心脏中的表达。构建lncRNA U90926的ORF-Flag标签融合质粒并包装慢病毒表达载体,使用Flag抗体确定lncRNA编码短肽的表达;设计、合成MPM-87多肽序列,并免疫家兔制备特异性抗体,western blot检测MPM-87在巨噬细胞极化过程中的内源性表达;免疫荧光及核质分离蛋白免疫沉淀确定MPM-87在巨噬细胞中的定位;检测MPM-87在正常及CVB3感染小鼠心脏组织内的表达;构建MPM-87的ORF序列(ORF)、U90926的全长序列(U90926)和MPM-87的ORF起始密码子突变(ATG突变为ATT)的U90926全长序列(U90926-ORFmut)的FLAG融合质粒慢病毒表达载体感染RAW264.7巨噬细胞,q RT-PCR、流式细胞术、杀菌实验检测MPM-87在巨噬细胞极化中的作用;免疫共沉淀及质谱分析筛选MPM-87的互作蛋白。结果:应用生物信息学软件Mi Pepid(https://***/Mind AI/Mi Pepid)这一基于机器学习的微肽识别工具对所注释的巨噬细胞中差异表达的lncRNAs序列进行小开放阅读框s ORFs的鉴定及编码潜能的预测;通过设定编码潜能的阈值(Coding Probability0.9),共筛选出65个具有编码潜能的巨噬细胞极化相关lncRNAs。根据筛选结果,选择编码潜能较高的lncRNA U90926做后续功能探讨。q RT-PCR结果显示lncRNA U90926在M1巨噬细胞中表达上调,si RNA沉默lncRNA U90926表达后,利用q RT-PCR检测M1型巨噬细胞的标志物表达,发现i NOS、TNF-α、IL-12的表达显著降低,提示lncRNA U90926分子能够促进巨噬细胞的M1极化。通过对lncRNA U90926的序列进行分析,我们找到一个264nt的小开放阅读框s ORF,可编码87个氨基酸的微肽,初步将编码的微肽命名为MPM-87(macrophage polarization micropeptide-87aa,MPM-87)。使用Flag抗体检测构建的MPM-87的ORF序列(ORF)、U90926的全长序列(U90926)和MPM-87的ORF起始密码子突变(ATG突变为ATT)的U90926全长序列(U90926-ORFmut)的FLAG融合质粒慢病毒表达载体感染的RAW264.7巨噬细胞,确定只有MPM-87的ORF序列(ORF)、U90926的全长序列(U90926)组可表达FLAG融合蛋白,而对照组和ORF起始密码子突变(ATG突变为ATT)的U90926全长序列(U90926-ORFmut)组不能表达FLAG融合蛋白。利用制备的抗MPM-87多抗,在RAW264.7巨噬细胞系中通过免疫荧光的方法检测M0和M1细胞中的微肽MPM-87的表达,结果显示,MPM-87在巨噬细胞胞胞浆和胞核中均有表达;免疫印迹验证MPM-87在M1巨噬细胞中的表达显著高于在M0巨噬细胞中的表达。此外,我们还确定与正常小鼠相比,MPM-87在VM小鼠心脏浸润的巨噬细胞中表达明显升高。用q RT-PCR、流式细胞术以及大肠杆菌杀菌实验检测构建的MPM-87的ORF序列(ORF)、U90926的全长序列(U90926)和MPM-87的ORF起始密码子突变(ATG突变为ATT)的U90926全长序列(U90926-ORFmut)的FLAG融合质粒慢病毒表达载体感染的RAW264.