基于重组关切变异株RBD表位的SARS-CoV-2小广谱疫苗研究

作     者：李亚飞 

作者单位：大理大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘奇

授予年度：2023年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：SARS-CoV-2 重组表位蛋白抗原 小广谱 VOC 疫苗 

摘      要：目的:新型冠状病毒即严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-Co V-2)及其关切变异株(Variants of Concern,VOC)的广泛流行,对全球健康和经济发展构成严重威胁。鉴于一代SARS-Co V-2疫苗不能有效阻断各种VOC流行株的二次感染,本研究拟构建一种针对SARS-Co V-2及其VOC病毒株感染的小广谱疫苗。方法:于NCBI数据库中下载SARS-Co V-2及各VOC病毒株S蛋白高质量完整氨基酸序列。通过序列对比及分析,明确其功能分区并选出各VOC病毒株中占比高的RBD区氨基酸序列。利用生信分析软件预测B细胞线性表位,结合前人报道的能够与相关中和抗体结合的区域选出优势表位。将优势表位通过组织蛋白酶S最小活性肽段(LMRK)和(LRMK)连接,以帮助APC定点切割并精准加工提呈。最终得到两个重组候选疫苗分别命名为BLEP-1、BLEP-2,对两种蛋白进行理化性质、二级及三级结构预测。合成BLEP-1、BLEP-2的编码基因并插入到原核表达载体p ET-21a中,得到质粒p ET-21a-BLEP-1(LMRK片段连接)和p ET-21a-BLEP-2(LRMK片段连接),并进行蛋白原核诱导表达及诱导温度、IPTG诱导浓度、蛋白表达形式等条件优化以提高蛋白表达量。使用组织蛋白酶S分别与BLEP-1、BLEP-2作用,观察两蛋白是否能被组织蛋白酶S水解。成功获得BLEP-1、BLEP-2蛋白后,配合佐剂采用皮内多点注射的方式,分别以高(40μg/只)、中(20μg/只)、低(10μg/只)三种不同剂量免疫小鼠。每次免疫后10天取静脉血,-80℃冻存。通过ELISA评价并比较两种候选疫苗的免疫原性,同时进行抗体效价测定。为了明确其是否可针对Wuhan-Hu-1和Omicron产生免疫应答,我们采用Wuhan-Hu-1 S蛋白和Omicron S1蛋白刺激小鼠免疫脾脏细胞后,进行IFN-γ、IL-2、IL-4细胞因子的测定,研究其诱导的免疫类型及水平。最后,为了研究两种候选疫苗免疫小鼠后所诱导的抗体是否对SARS-Co V-2具有抑制作用,我们在前期成功构建的细胞-细胞融合模型基础上,优化实验条件并绘制了时间-融合曲线,选出最适观测时间,并在此模型上测试了免疫血清对模型的抑制活性作用。结果:SARS-Co V-2 RBD区的中和抗体结合位点集中区域为aa402-421、aa444-460、aa470-477、aa480-505,结合B细胞线性表位及抗原性预测等生物信息学分析结果,筛选出RBD区中包含各突变位点的优势肽段为aa404-aa414、aa413-aa424、aa419-aa430、aa435-aa445 aa441-aa451、aa450-aa461、aa458-aa467、aa469-aa479、aa482-aa493、aa494-aa456。经过组织蛋白酶S最小活性片段(LMRK)和(LRMK)连接后获得的BLEP-1和BLEP-2,其蛋白理化性质、二级结构预测结果相近;三级结构预测结果显示BLEP-2比BLEP-1有更多肽段暴露于蛋白表面。采用BL-21作为表达菌株时,BLEP-1于37℃0.5 mmol/L IPTG浓度条件下,BLEP-2于28℃0.5 mmol/L IPTG浓度条件下诱导12 h后成功表达出目的蛋白,且两蛋白均为包涵体表达形式。通过变性、柱上复性、洗涤洗脱条件摸索等步骤成功获得大量高纯度的目的蛋白;BLEP与组织蛋白酶S作用结果显示组织蛋白酶S能水解BLEP-2,而对BLEP-1作用不明显。小鼠免疫结果显示BLEP-1、BLEP-2蛋白中剂量组(20μg/只)免疫效果最佳。BLEP-1中剂量组三次免疫后,能与Wuhan-Hu-1 S蛋白、Wuhan-Hu-1 S1蛋白、Ocmicron S1蛋白特异性结合的Ig G抗体效价分别可达到1:3,200、1:12,800、1:800;而BLEP-2蛋白中剂量组分别可达到1:6,400、1:12,800、1:10,2400,均产生了高水平的抗体反应。刺激免疫小鼠脾细胞细胞因子测定结果显示,BLEP-1和BLEP-2免疫组IL-4表达水平增高(P0.001),提示能诱导一定的Th2偏向反应;同时,IFN-γ、IL-2表达水平显著增高(P0.001)更多的是诱导了Th1偏向细胞免疫反应。免疫血清对SARS-Co V-2细胞-细胞融合模型的抑制试验结果显示,BLEP-2中剂量组免疫血清抑制细胞-细胞融合效果最好,其IC约为1:110稀释。结论:候选疫苗BLEP-1和BLEP-2具有良好的免疫原性,可以诱导小鼠产生高滴度的抗Wuhan-Hu-1、Ocmicron特异性Ig G抗体,并能有效抑制SARS-Co V-2 S蛋白介导的细胞-细胞融合,其中由LRMK位点连接的BLEP-2免疫效果优于BLEP-1。此外两种候选疫苗均能诱导机体产生特异性Th1/Th2混合型免疫应答,具有成为SARS-Co V-2新型疫苗候选抗原的潜力。