小猿叶甲清道夫受体SR-B4对蝉拟青霉的免疫反应研究

作     者：张铭宇 

作者单位：安徽农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：党向利

授予年度：2023年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：小猿叶甲 病原真菌 蝉拟青霉 昆虫免疫 清道夫受体 

摘      要：小猿叶甲(Phaedon brassicae Baly)是一种十字花科蔬菜上的重要害虫,危害严重。目前该害虫的防治主要依靠化学防治。过度依赖化学杀虫剂进行防治,会导致环境污染和害虫抗药性产生。昆虫病原真菌可用于抗药性害虫的治理,然而害虫通过自身免疫抵御病原真菌的侵染是导致病原真菌杀虫缓慢、防治效果不理想的原因之一。阐明害虫抵御病原真菌侵染的免疫机制,可为更好地利用真菌防治害虫提供理论基础及杀虫靶标。基于此,本文测定了病原真菌蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)对小猿叶甲幼虫的毒力。对蝉拟青霉侵染的小猿叶甲幼虫进行转录组测序,筛选和鉴定小猿叶甲免疫相关基因。通过生物信息学方法对免疫基因的功能域和系统发育关系进行分析,并对蝉拟青霉侵染后免疫基因的表达模式进行表征。对模式识别受体中的清道夫家族(Scavenger receptor,SR)基因,利用RT-q PCR对蝉拟青霉侵染前后他们的表达量进行检测,对上调表达最显著的SR-B4基因的免疫功能进行研究。主要结果如下:1.蝉拟青霉对小猿叶甲毒力测定、蝉拟青霉侵染小猿叶甲转录组测序及分析蝉拟青霉对小猿叶甲幼虫毒力测定结果表明,蝉拟青霉能够有效杀死小猿叶甲幼虫,1.0×10～7spores/m L处理9 d后幼虫全部死亡。对蝉拟青霉侵染和未侵染小猿叶甲幼虫进行转录组测序,组装后获得160164个unigene。其中侵染后差异上调表达基因有4272个,下调表达基因有10399个。KEGG富集分析显示差异基因主要富集于胆汁分泌、溶酶体、Toll与IMD等信号通路、受体互作、酪氨酸代谢过程及细胞凋亡等。这些途径与昆虫免疫相关,在昆虫对病原体入侵的反应中具有重要作用。2.免疫基因筛选、生物信息学及表达模式分析从小猿叶甲转录组中共筛选获得214个免疫相关基因,包括47个模式识别受体基因,62个信号通路基因以及105个免疫效应物和其他效应子基因。在筛选出的免疫相关基因中有95个显著差异表达,其中上调表达64个,下调表达31个。利用RT-q PCR对随机选择的21个差异表达免疫基因在蝉拟青霉侵染后的表达量进行检测,发现他们在蝉拟青霉侵染后存在差异表达,测定结果与转录组分析结果一致。3.清道夫受体基因SR-B4免疫功能研究小猿叶甲转录组中共鉴定出20个SR基因,包括3个SR-A、16个SR-B和1个SR-C。利用RT-q PCR对其中18个SR基因在蝉拟青霉侵染前后表达模式进行表征,结果显示其中11个SR基因显著上调表达,且SR-B4基因表达量最高,是对照组的16.16倍。小猿叶甲SR-B4基因ORF序列长1515 bp,编码504个aa,具有保守的CD36功能域。注射ds SR-B4的小猿叶甲幼虫在蝉拟青霉侵染5 d后全部死亡,而注射ds GFP组仍有44.44%幼虫存活,表明小猿叶甲SR-B4基因具有免疫功能。利用大肠杆菌BL21细胞重组表达了SR-B4蛋白高度保守的重要CD36功能域蛋白。微生物凝集实验结果表明,重组蛋白CD36具有明显的凝集细菌细胞和蝉拟青霉孢子的能力,暗示其可能参与细胞免疫。小猿叶甲体内微生物清除实验表明,CD36蛋白能够显著清除小猿叶甲体内的蝉拟青霉、大肠杆菌(Escherichia coli)与金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。这些结果表明SR-B4基因参与昆虫的免疫反应,在小猿叶甲抵御蝉拟青霉侵染的免疫应答中发挥重要作用。本研究有助于阐明害虫对病原真菌的免疫机制,为更好地利用病原真菌防治害虫提供理论依据和可能的杀虫靶点。