褪黑素与维生素C缓解醋酸铅诱导的小鼠睾丸氧化损伤

作     者：赵泽民 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王鲜忠

授予年度：2023年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 07[理学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 0713[理学-生态学] 

主      题：醋酸铅 褪黑素 维生素C 氧化应激 睾丸 

摘      要：环境尤其是水质和土壤中的有毒重金属铅随着工业发展而持续富集在人体和动植物体内,严重者危害生物体健康。生殖系统是对环境污染物最敏感的系统之一,动物遗传物质的传递离不开生殖系统的健康。而雄性动物生殖功能障碍将大幅度降低繁殖性能,增加商品养殖业的经济成本。氧化应激被认为是铅中毒的潜在分子机制,为了探究醋酸铅对雄性生殖功能的影响及机制,找到能缓解其毒性作用的对策,本研究比较了外源性添加两种抗氧化剂褪黑素和维生素C治疗醋酸铅诱导的生殖毒性效果,为缓解铅中毒提供新的思路和方法。本研究以500 mg/L浓度的醋酸铅构建雄性小鼠铅中毒模型,试验分成六个处理组,包括NC组(阴性对照组)、Pb组(醋酸铅处理组)、Pb+MT组(褪黑素治疗组)、Pb+VC组(维生素C治疗组)、MT组(褪黑素对照组)、VC(维生素C对照组)。第12周后采集新鲜血液测定血清睾酮水平和血常规分析;再取出睾丸组织和附睾,以及经附睾尾释放获得附睾精子。首先在光学显微镜下检测精子品质,HE染色后观察睾丸组织结构;其次通过免疫荧光检测睾丸ROS水平,通过生化试剂盒进行氧化/抗氧化水平的检查;利用免疫印迹试验和RT-q PCR技术分析了醋酸铅、褪黑素、维生素C对睾丸结构和功能相关蛋白和基因水平的影响;最后检测有关信号通路的变化以揭示醋酸铅影响睾丸损伤的具体毒理学机理。研究结果如下:1.与NC组相比,Pb组睾丸系数显著降低(P0.01),HE染色结果显示,Pb组睾丸组织整体结构紊乱,部分生精小管间隙增大,管腔内各级生精细胞数量的减少,细胞之间的排列稀松不齐,生成的精子细胞有所缩减。相应地,精子数量和精子活力明显下降(P0.01),精子畸形率也显著增加(P0.01)。2.Pb组小鼠血清睾酮水平明显下降(P0.01),同时,类固醇激素合成酶CYP17A1、HSD17β3蛋白水平以及CYP11A1、CYP17A1、HSD17β3 m RNA表达水平明显下调(P0.01)。3.与NC组相比,Pb显著增加了ROS水平和氧化指标LPO(P0.01)和MDA含量(P0.01),抑制了抗氧化指标T-AOC、SOD和GSH水平(P0.01)。同时,ATP、乳酸水平显著下降(P0.01)。4.相较于NC组,Pb组全血中的白细胞总数、中性粒细胞数、淋巴细胞数显著增多(P0.01),促炎细胞因子TNF-α、IL-6的蛋白表达水平增多(P0.01),同时NF-κB的磷酸化水平上调(P0.01)。5.Pb显著降低了睾丸组织紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-11蛋白水平(P0.01),并提高了ERK1/2的磷酸化水平(P0.01)。6.Pb显著上调了磷酸化Akt水平(P0.01),但PI3K磷酸化水平未发生显著变化。7.与Pb组相比,Pb+MT组睾丸组织中ROS水平逐渐恢复至正常水平(P0.01),T-AOC、GSH水平显著提高(P0.01),LPO和MDA水平下降明显(P0.01)。小鼠血清睾酮水平显著上升(P0.01),类固醇激素合成相关酶CYP11A1、CYP17A1、HSD17β3 m RNA表达水平显著上调(P0.01)以及CYP17A1(P0.05)、HSD17β3(P0.01)蛋白水平也明显增加;MT还有效改善了Occludin蛋白表达水平(P0.01),提高精液品质(P0.01)。在抗炎症方面,Pb+MT组明显降低了血液中总白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数量以及TNF-α、IL-6的蛋白表达水平(P0.01)。8.与Pb组相比,Pb+VC组睾丸T-AOC水平显著上升、GSH含量明显升高(P0.01),LPO、MDA水平下降明显(P0.01);而且,Pb+VC组精液品质也有相应的恢复,并在一定程度上修复了曲细精管的组织形态;同时,VC也能使促炎细胞因子蛋白表达下降(P0.01),全血中白细胞数、中性粒细胞数、淋巴细胞数减少,NF-κB活性抑制明显(P0.01)。与MT治疗组相比,Pb+VC组睾丸系数明显恢复至正常水平(P0.01),SOD活性明显有所回升(P0.01),ZO-1的蛋白表达明显增加(P0.01)。根据以上研究结果,得出以下结论:1.醋酸铅诱导雄性小鼠睾丸氧化损伤,主要是氧化和抗氧化水平失衡所致。它诱发与类固醇激素合成酶的表达水平下调,血清睾酮水平降低,但炎症反应加剧,导致ATP和乳酸水平降低,睾丸形态和结构改变,精子质量下降。而醋酸铅的上述作用可能通过激活Akt/NF-κB信号通路发挥作用。2.褪黑素抑制醋酸铅诱导的睾丸ROS产生,提高血清睾酮和类固醇激素合成酶水平,降低总白细胞、中性粒细胞以及淋巴细胞的数量,并下调TNF-α、IL-6蛋白水平的表达,改善睾丸形态结构,提高精子数量,降低精子畸形率。3.维生素C具有与褪黑素类似的缓解作用,但维生素C在恢复SOD活性和增加ZO-1蛋白水平方面更有效。综上,醋酸铅可能诱发氧化应激激活Akt/NF-κB信号通路以及ERK1/2信号影响睾丸组织结构和功能,褪黑素和维生素C均可缓解醋酸铅诱导的睾丸氧化损伤,而维生素C的效果优于褪黑素。