基于纳米抗体免疫磁珠的AFB1免疫层析试纸条构建及抗原模拟表位淘选

作     者：贺晓薇 

作者单位：南昌大学 

学位级别：硕士

导师姓名：何庆华;李燕萍;刘师文

授予年度：2023年

学科分类：09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 

主      题：黄曲霉毒素B1 纳米抗体 免疫磁珠 抗原模拟表位 免疫层析 

摘      要：黄曲霉毒素B(Aflatoxins B,AFB)是曲霉属真菌产生的一种有毒次级代谢产物,具有很强的致癌性和肝毒性,常见于被污染的玉米、花生及大米中,会造成严重的经济损失并威胁食品安全,因此建立一种快速、灵敏、准确的检测方法是十分必要的。在真菌毒素的免疫分析检测中一般以传统的单克隆抗体和化学合成抗原作为元件,但单克隆抗体的制备过程复杂且成本较高,化学合成抗原的制备存在价格昂贵、危害操作人员健康等限制因素。而纳米抗体以其制备简单、性质稳定、生产成本低等优点,在真菌毒素的免疫检测逐渐显现出独特优势。本研究以抗AFB纳米抗体为元件,制备了抗AFB纳米抗体免疫磁珠,并将其应用于AFB免疫层析试纸条中,另外,为获得能与抗AFB纳米抗体配对使用的检测抗原模拟物,为AFB无毒绿色免疫分析方法的建立提供基础,本研究还开展了以AFB纳米抗体为配体,投入噬菌体随机展示十二肽亲和淘选AFB抗原模拟表位的探索研究,取得的主要研究结果如下:1)原核表达抗AFB纳米抗体,间接竞争ELISA测得其与AFB单克隆抗体的IC分别为4.17 ng/m L、0.36 ng/m L,之后以该纳米抗体为研究对象,分别采取MNPs@Nb、MNPs@SA@Nb、MNPs@Catcher@Nb三种方法制备抗AFB纳米抗体免疫磁珠,通过ELISA、测定Zeta电位以及BCA蛋白定量的方法对偶联效果进行表征,结果表明,MNPs@Nb、MNPs@SA@Nb、MNPs@Catcher@Nb三种免疫磁珠均成功制备,偶联量分别为22.00mg/mg、27.76mg/mg、24.15mg/mg。2)以前期制备的MNPs@Nb、MNPs@Catcher@Nb、MNPs@SA@Nb为新型信号探针,建立基于抗AFB纳米抗体的免疫层析试纸条检测方法。最优条件下,MNPs@Nb、MNPs@Catcher@Nb、MNPs@SA@Nb的试纸条肉眼判读检测AFB的灵敏度分别为4.0、4.0、6.0 ng/m L,与传统的AFB胶体金试纸条比较,灵敏度提高一倍。基于MNPs@Nb、MNPs@Catcher@Nb、MNPs@SA@Nb探针所建立免疫层析试纸竞争抑制曲线,其IC分别为0.25 ng/m L、0.16 ng/m L、0.45ng/m L。特异性实验表明,所构建的三种免疫层析试纸条与其他真菌毒素(DON、ZEN、OTA、FB)均无交叉。在花生油提取液中添加AFB标准品进行加标回收实验,加标回收率为81～121.3%,变异系数为9.3～14.2%,表明三种试纸条均具有较好的准确性和精密度。3)以抗AFB纳米抗体为靶分子,分别采取基于MNPs@Nb的液相淘选和基于Spy Tag-Catcher自组装的固相淘选两种方法从噬菌体展示十二肽库中筛选AFB抗原模拟表位,两种方法的阳性率分别为3.1%和30.9%,测序后发现-LSFQYHKVPQGG-、-STLLLSGAVDIW-两个序列得到富集,但并未获得AFB的抗原模拟表位。