大青杨PuAHL17基因抗旱功能研究

作     者：孙佳丽 

作者单位：东北林业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李成浩

授予年度：2023年

学科分类：08[工学] 0829[工学-林业工程] 

主      题：大青杨 AT-hook蛋白 抗旱 PuAHL17 活性氧清除 

摘      要：AT-hook蛋白在植物生长发育、器官构建、非生物胁迫和激素信号传导等应答中都起着至关重要的作用,与此同时该蛋白也可以调节有关转录因子的转录活性或者辅助转录因子进行转录,从而提高其转录活性;有研究报道AT-hook蛋白作为转录因子,可与光敏色素相互作用因子(PIFs)相互拮抗从而促进生长和激素等相关基因的转录。并且在之前的报道中,大多数是以草本植物为研究对象来研究AT-hook蛋白,而对木本植物的研究相对较少。因此本研究以大青杨为实验材料,通过生物信息学的方法对其蛋白进行了预测分析;同时也阐明了在干旱胁迫下大青杨PuAHL17基因的表达模式,并对其进行了抗旱功能的相关研究。主要结果如下:(1)通过荧光实时定量PCR(qRT-PCR)技术,分别在6%PEG6000、脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(Me JA)、水杨酸(SA)以及氯化钠(Na Cl)等胁迫的处理下对大青杨的PuAHL17基因进行了表达模式的分析。结果表明,在6%PEG6000模拟的干旱胁迫下,在大青杨的根和叶中PuAHL17基因的表达量都显著上调,并且在叶中的表达量高于根部。利用Plant Care网页在线分析预测PuAHL17基因启动子元件的功能,发现其启动子区域含有ABRE、ARE、MRE和MBS等与干旱胁迫响应有关的应答元件。从大青杨的基因组中克隆出PuAHL17基因启动子序列,利用根癌农杆菌介导的叶盘法获取pro PuAHL17::GUS转基因大青杨植株,并对其转基因组培苗进行GUS染色实验,结果显示未经胁迫正常条件下大青杨的根和叶片都染色较浅,而6%PEG6000模拟的干旱胁迫后,根和叶片中染色显著加深。(2)通过亚细胞定位实验发现大青杨PuAHL17基因的转录因子定位于细胞核。使用银中杨原生质体瞬时表达法对该基因进行了转录活性分析,构建PuAHL17-BD载体进行酵母激活活性实验表明PuAHL17无转录激活活性。(3)构建35S启动子驱动的PuAHL17过表达(PuAHL17-OE)载体和35S启动子驱动PuAHL17抑制表达(PuAHL17-RNAi)载体,利用根癌农杆菌介导的叶盘法进行大青杨遗传转化,共获得14个PuAHL17-OE株系和4个PuAHL17-RNAi株系。在6%PEG6000胁迫下,对WT与PuAHL17-OE株系的抗旱性进行分析比较。结果显示,在6%PEG6000模拟的干旱胁迫下,PuAHL17-OE株系根部与茎叶部分的干重均比野生型(WT)植株重,根和茎叶中的对电导率、过氧化氢和丙二醛含量均显著降低,而脯氨酸、过氧化物酶活性和超氧化物歧化酶含量均显著增高。综上所述可知,PuAHL17是定位在细胞核上的转录因子,并且其过表达能够通过提高活性氧的的清能力(ROS)并积累更多的脯氨酸等来提高大青杨的抗旱性。