金黄色葡萄球菌肠毒素B纳米抗体的筛选及活性评估

作     者：朱梅君 

作者单位：湖北大学 

学位级别：硕士

导师姓名：魏子贡

授予年度：2023年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：酿酒酵母表面展示 金黄色葡萄球菌 肠毒素B 纳米抗体 流式细胞仪 

摘      要：金黄色葡萄球菌是一种人畜共患致病菌,其引起的感染在全世界范围内流行,包括中毒性休克综合征和菌血症。此前针对金黄色葡萄球菌感染的治疗集中在抗生素上,但伴随着抗生素滥用,产生了一种致病能力更强的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus;MRSA),肠毒素B(Staphylococcal enterotoxin B,SEB)在其中更是扮演着重要角色,作为超级抗原主要与MHC-Ⅱ分子和TCR上的Vβ区结合导致IL1β、TNF-α等各种炎症细胞因子不受控制的释放,产生炎症反应,因此遏制SEB的功能非常重要。目前针对SEB的抗体和疫苗均停留在研究阶段,大多数集中在使用单克隆抗体来抑制SEB与其受体的结合,但是单克隆抗体本身分子量较大,导致穿透能力有限,难以满足临床应用的需求。然而,从HcAb的可变区域演变出的纳米抗体VHH具有更强、更快的组织穿透力,可以到达实体瘤等致密组织发挥作用,同时在肾脏的过滤作用下,在血液中的半衰期相对较短,并且能避免毒素积累,在抗体药物的开发中有很大优势。本研究通过构建一个库容量大小为5×10的纳米抗体文库,结合酿酒酵母表面展示和流式细胞仪筛选技术,筛选到了8个能够特异性结合金黄色葡萄球菌SEB的纳米抗体。随后,利用不同浓度的SEB蛋白来检测这8个纳米抗体的结合能力,发现它们的Kd值为20-150 nM。另外,这8个纳米抗体中SEB S12-20、SEB S10-11、SEB S12-2、SEB S10-7、SEB S12-10都能在大肠杆菌中进行高效表达,其中纳米抗体SEB S12-20纯化后的浓度可以达到1.5 mg/mL。最后,通过细胞实验验证了纳米抗体SEB S12-20和SEB S10-11中和SEB的活性,发现仅有SEB S12-20在浓度为5μg/mL时,能显著降低小鼠脾脏细胞中IL1β、TNF-α的转录水平,同单独使用SEB蛋白刺激相比,联合使用纳米抗体SEB S12-20后,IL1β、TNF-α的转录水平平均值分别降低了7.6倍、8.55倍,说明本实验筛选出的纳米抗体SEB S12-20有效减弱了SEB引起的炎症反应。最后,利用AlphaFold2对纳米抗体结构进行模拟,再利用DS软件中的ZDOCK和RDOCK对模拟的纳米抗体结构与SEB进行分子对接,发现纳米抗体SEB S12-20与TCR及MHC-Ⅱ竞争性结合SEB分子,从而抑制SEB的功能,而SEB S10-11结合在SEB分子中的其它部位。综上所述,本研究筛选得到的纳米抗体SEB S12-20在诊断或治疗SEB引起的相关疾病方面有良好的应用前景。