安徽省草地贪夜蛾对常用杀虫剂抗性监测及靶标突变检测

作     者：卢静波 

作者单位：安徽农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：盛成旺;钟永志

授予年度：2023年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：草地贪夜蛾 抗药性监测 乙酰胆碱酯酶 鱼尼丁受体 LAMP技术 

摘      要：草地贪夜蛾[Spodoptera frugiperda(J.E.Smith)]是一种原产自美洲地区的毁灭性农业害虫,2019年5月入侵安徽省黄山市,并迅速扩散,由于缺少原产地天敌等因素的制约,极易爆发成灾。由于长期不合理的杀虫剂的使用,导致草地贪夜蛾对部分杀虫剂产生了不同程度的抗药性。开展和加强抗药性监测与靶标突变检测,可以指导化学药剂的合理使用,延缓抗药性发展速度。环介导等温扩增检测方法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)与PCR法相比具有简单快速、高效、可视化、低成本的特点,可以更好的应用于草地贪夜蛾靶标突变检测。1.安徽省草地贪夜蛾田间种群对常用杀虫剂的毒力测定本研究采用饲料混毒法对2022年安徽省草地贪夜蛾田间种群对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂和其它常用新型杀虫剂的毒力测定,研究结果发现,草地贪夜蛾对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂敏感性相较于实验室相对敏感品系没有显著上升,但毒力水平低于甲维盐、乙基多杀菌素和氯虫苯甲酰胺等其他常用杀虫剂。田间种群的草地贪夜蛾对茚虫威和乙基多杀菌素的抗性倍数均在2.0倍以下,但阜阳地区和蚌埠地区的草地贪夜蛾对甲维盐产生3.69倍和6.08倍抗性,蚌埠品系、阜阳品系和合肥品系的草地贪夜蛾对氯虫苯甲酰胺分别产生5.11倍、7.33倍和10.52倍抗性。因此,在使用甲维盐和氯虫苯甲酰胺等杀虫剂防治草地贪夜蛾时需要加强抗药性监测。2.PCR法检测常用杀虫剂的靶标突变情况采用PCR法对2022年安徽省田间草地贪夜蛾乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)、鱼尼丁受体(Ryanodine receptor,RyR)、电压门控钠离子通道(Voltage-gated sodium channel,VGSC)、烟碱型乙酰胆碱受体(Nicotinic acetylcholine,nAChRs)α6亚基和谷氨酸门控氯离子通道(Glutamate-gated chloride channel,GluCl)相关的靶标位点进行突变检测。测序发现,在ace-1基因存在A201S存在杂合突变,F290V位点纯合、杂合突变,且田间种群草地贪夜蛾ace-1基因的A201S和F290V突变频率高于实验室相对敏感品系。同时在合肥地区的草地贪夜蛾检测到RyR存在I4734M杂合突变(发生频率1/60),而其它检测的靶标位点均为敏感纯合子。研究结果表明入侵安徽省的草地贪夜蛾携带与有机磷和氨基甲酸酯类、双酰胺类杀虫剂抗性相关的突变,未携带与甲维盐、茚虫威和乙基多杀菌素抗性相关突变。3.LAMP法检测有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂靶标突变为了快速检测有机磷类和氨基甲酸酯类杀虫剂靶标突变频率,本研究基于LAMP技术分别建立了草地贪夜蛾ace-1基因A201S和F290V突变快速检测方法。通过在草地贪夜蛾ace-1基因A201S和F290V位点分别设计2对特异性引物,进行LAMP扩增,LAMP反应体系均在68℃水浴反应85 min突变样品的反应液由粉色变为黄色,而未突变的样品不变色。而且LAMP反应结果特异性强,灵敏性好,可以检测到低至1 pg/μL的样品。利用提取的田间草地贪夜蛾DNA样品进行LAMP检测,结果与PCR方法检测一致,准确率达到100%。LAMP法操作简便快速、特异性好,可以用于草地贪夜蛾对有机磷类和氨基甲酸酯类杀虫剂靶标突变田间检测。4.LAMP法检测双酰胺类杀虫剂靶标突变为了快速筛选到草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂低水平靶标突变,本研究基于LAMP技术筛选出可以分别检测与双酰胺类杀虫剂抗药性相关的RyR上I4734L、I4734V和I4734M突变的LAMP引物组。通过在相同位置设计I4734L、I4734V和I4734M不同突变类型的FIP、F3、B3三条引物,仅BIP引物不同,因此在同一个LAMP反应体系中即可检测草地贪夜蛾RyR是否存在I4734位点一种或多种形态突变。LAMP反应体系在65℃水浴孵育65 min即可观察到颜色的变化。建立了LAMP法可以检测RyR上G4891E位点突变,通过在G4891E位点设计两对特异性引物进行LAMP扩增,在68℃下水浴85 min后突变样品溶液由粉色变为黄色,未突变样品和清水对照不变色。LAMP法稳定性高、耗时短、操作简便、灵敏度高,一次性可以检测到I4734位点一种或多种形态突变,适合田间快速检测草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性的分子检测,为草地贪夜蛾综合防治提供依据。