基于活性的化学蛋白组学研究咖啡酸的抗炎靶点及机制

作     者：邱梁佳 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王继刚

授予年度：2023年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：炎症 咖啡酸 蛋白二硫键异构酶 PERK NF-κB 

摘      要：研究背景炎症是一种机体的常见病理过程,与各类疾病相关,如癌症、糖尿病、动脉粥样硬化以及肥胖等。目前临床上常见的抗炎药物均存在各种不良反应,寻找新型的抗炎药物尤为重要,而安全性高的天然化合物成为研究重点。我们关注到了咖啡酸(3,4-二羟基肉桂酸,Caffeic acid,CA),一种酚类化合物分子,广泛存在于许多植物中,以及日常饮品咖啡和茶中。CA具有抗氧化剂、抗炎、抗肿瘤、免疫调节,以及对心血管系统的保护作用等多种生物活性。目前,很少有研究揭示CA的特异性抗炎靶蛋白及其分子机制,且并不深入。基于活性的化学蛋白组学(Activity-basedproteinprofiling,ABBP)是一种化学蛋白质组学方法,用来阐明生物活性小分子和蛋白质靶点之间的相互作用机制,该方法在蛋白质组学水平上具有高通量鉴定和定量靶点的优势。研究目的为了阐明CA的抗炎作用机制,我们使用ABPP方法来分析CA抗炎靶点及其通路机制,并通过其他药理学实验来验证靶点的可信度。研究方法1、建立LPS刺激的急性肺炎小鼠模型,以阳性药地塞米松(Dexamethasone,DEX)为对照,连续14天给药后观察肺部病理学切片,并检测血清中的炎症因子,肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素 6(Interlukin-6,IL-6)。进一步,合成CA探针(CA-P),通过氢谱和质谱分析其化学结构。建立脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激的RAW264.7细胞炎症模型,检测细胞上清中的TNF-α和IL-6以及其在细胞中的表达。2、探针与LPS刺激的RAW264.7细胞共孵育,设置标记组、竞争组以及对照组通过点击化学反应富集探针标记蛋白,通过SDS-PAGE荧光信号观察探针标记以及竞争效果并进行LC-MS/MS以及生信分析。3、根据ABPP结果选择蛋白二硫键异构酶(Protein disulfide isomerase,PDI)进行验证。通过Pull down法、探针标记纯蛋白,荧光共定位以及细胞热位移实验(Cellular thermal shift assay,CESTA)等传统分子生物学实验来验证。4、分析CA以及氧化后的CA对PDI的酶活以及PDI氧化还原态的影响,并进一步研究其分子机制,即CA与PDI的结合位点,通过碘乙酰胺探针(Iodoacetamide-Probe,IAA-Probe)以及 LC-MS/MS 研究结合位点,并通过突变体验证。5、最后,通过PDI抑制剂以及敲低实验研究了 CA对PDI/PERK(蛋白激酶 R 样内质网激酶,Protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase)/NF-κB(核因子 κB,Nuclear factor kappa-B)通路的影响。研究结果1、体内实验结果表明,CA给药后能缓解肺炎病理症状,显著清除血清炎症因子。确定了 CA-P其结构,并从体外实验验证了 CA和CA探针的抗炎效果,CA给药后能显著清除细胞上清炎症因子以及抑制其细胞表达。2、CA-P的标记浓度为50μM,10倍浓度的CA可将荧光信号竞争掉。LC-MS/MS以及生信分析结果表明PDI是可信度最高的蛋白。3、传统分子生物学实验证明了 CA和PDI存在直接结合,是CA抗炎的结合靶点。4、氧化后的CA能够抑制PDI的酶活。其机制是通过共价结合PDI的酶活位点四个半胱氨酸-Cys53、Cys55、Cys399和Cys401抑制PDI的酶活口袋。5、CA靶向PDI起到抗炎作用,是通过PDI/PERK/NF-κB通路介导的。研究结论以上结果表明,CA在体内外均具有良好的抗炎效果,CA进入细胞后被氧化,与PDI共价结合抑制其还原活性,从而抑制PDI/PERK/NF-κB通路蛋白的表达,起到抗炎的效果。