GPR137B介导自噬参与动脉粥样硬化发病的机制研究

作     者：程警霈 

作者单位：赣南医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：王烈峰;张书永

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：动脉粥样硬化 自噬 溶酶体 GPR137B 

摘      要：目的:探讨溶酶体膜蛋白受体GPR137B与自噬以及动脉粥样硬化的相关性,进一步探索GPR137B通过参与自噬途径影响动脉粥样硬化发病的可能机制。方法:1.对8周龄健康雄性ApoE小鼠进行高脂饲料喂养8周,建立动脉粥样硬化发病小鼠模型。取小鼠的肝脏与脾脏组织,分别提取组织RNA和组织蛋白,通过q PCR和蛋白免疫印迹实验(Western blot)分别检测造模小鼠肝脏和脾脏中GPR137B的表达水平。2.在人脐静脉血管内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)中,给予浓度为500 n M的自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA),以及不同的自噬抑制剂:浓度为500 n M的巴弗洛霉素A1(Bafilomycin A1,Baf A1),浓度为500μM的3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA),浓度为25μM的氯喹(Chloroquine,CQ),分别刺激6 h、12 h。通过Western blot检测GPR137B以及自噬相关蛋白LC3B-II/I和P62的表达水平。3.在小鼠巨噬细胞系Raw264.7中,给予不同浓度(50 n M,100 n M,200 n M)的自噬诱导剂RAPA和自噬抑制剂Baf A1分别刺激3 h、6 h、12 h。通过Western blot检测GPR137B及自噬相关蛋白LC3B-II/I和P62的表达水平,评估在Raw264.7细胞中诱导或抑制自噬是否影响GPR137B的表达水平。4.从C57BL/6背景的雄性小鼠(8-12周龄)体内分离得到小鼠原代骨髓巨噬细胞(Bone marrow derived macrophage,BMDM),给予自噬诱导剂RAPA(100 n M)和自噬抑制剂Baf A1(100 n M)分别刺激3 h、6 h、12 h。采用Western blot检测GPR137B及自噬相关蛋白LC3B-II/I和P62的表达水平,评估在BMDM细胞中诱导或抑制自噬是否影响GPR137B的表达水平。5.在293T细胞中转染GPR137B过表达质粒,观察转染后的荧光效率,采用Western blot检测GPR137B过表达后细胞中自噬相关蛋白LC3B-II/I、P62蛋白表达水平,评估GPR137B过表达后的自噬流变化。同时检测GPR137B过表达后,细胞中PI3K、Akt、m TOR、Erk1/2信号通路蛋白表达水平。此外,在293T细胞中转染GPR137B过表达质粒后,给予自噬抑制剂Baf A1(100 n M)和CQ(100μM)分别刺激3 h,采用Western blot检测处理后GPR137B及自噬相关蛋白LC3B-II/I和P62的表达水平。6.在293T细胞中转染GPR137B过表达质粒后,评估GPR137B对溶酶体功能的影响。采用Lyso-tracker Red染料对酸性溶酶体进行染色,观察过表达GPR137B对酸性溶酶体数量的影响。同时观察在GPR137B过表达的细胞中加入CQ(100μM)和Baf A1(100 n M)刺激3 h后,细胞中酸性溶酶体数量的变化。此外,采用Western blot检测过表达GPR137B后细胞中ATP6V1A的蛋白表达水平。7.建立泡沫细胞模型,从C57BL/6背景的雄性小鼠(8-12周龄)体内提取小鼠原代骨髓巨噬细胞BMDM进行培养;给予ox-LDL(100μg/ml)诱导48 h,通过油红O染色检测泡沫细胞造模情况。在BMDM细胞中给予ox-LDL(100μg/ml)分别刺激不同的时间点(3 h、6 h、12 h、24 h、48 h)。采用Western blot检测GPR137B以及自噬相关蛋白LC3B-II/I、P62的蛋白表达水平。结果:1.在mRNA水平,与正常小鼠相比,动脉粥样硬化造模组小鼠肝脏与脾脏组织中的GPR137B表达均明显升高。通过Western blot检测发现,与正常组小鼠相比,动脉粥样硬化造模组小鼠肝脏组织中GPR137B蛋白水平呈现明显升高。2.在HUVEC细胞中分别给予自噬诱导剂RAPA和自噬抑制剂Baf A1、3-MA、CQ刺激不同时间点后,与对照组相比,在自噬诱导剂处理组或自噬抑制剂处理组中,诱导或抑制自噬的效果不明显。3.在Raw264.7细胞中分别给予不同浓度的自噬诱导剂RAPA和自噬抑制剂Baf A1刺激不同时间点后,与对照组相比,RAPA处理组和Baf A1处理组的GPR137B表达水平均无明显变化。4.在BMDM细胞中分别给予自噬诱导剂RAPA和自噬抑制剂Baf A1刺激不同时间点后,与对照组相比,RAPA处理组和Baf A1处理组的GPR137B表达水平均无明显变化;5.在293T细胞中过表达GPR