基于PI3K-AKT信号轴探讨熟地黄-山茱萸配伍对Aβ25-35诱导的N2a细胞凋亡的保护作用

作     者：许原 

作者单位：辽宁中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王旭

授予年度：2023年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：阿尔茨海默病 熟地黄 山茱萸 细胞凋亡 PI3K-AKT 

摘      要：目的中医古籍文献中没有对阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的病名记载,根据临床症状将AD归属于“郁证、“呆病、“善忘等病症范围。从我们中医学的角度来说,虽然说AD病位在脑,但与肾有着密切的关系。大多数学者认为肾精亏虚、髓海不足等原因是造成AD的病理基础,同时在临床治疗上采取以补肾作为主要治疗法也纷纷取得了不错的治疗效果。在历朝历代熟地黄、山茱萸都是医学前辈们治疗阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)常用的补肾复方的药对之一,而目前有关熟地黄-山茱萸药对配伍治疗AD的药效物质基础及作用机制尚不确定。因此本文从网络药理学的研究角度分析熟地黄-山茱萸药对配伍抗AD的潜在靶点及目标信号通路,再应用Aβ(β-amyloid)25-35损伤N2a(mouse neuroblastoma N2a cells)神经细胞建立的AD细胞模型进行体外细胞实验,验证熟地黄-山茱萸药对配伍改善Aβ25-35损伤神经细胞的保护作用及相关机制,验证网络药理学结果的可靠性,同时为临床应用熟地黄-山茱萸醇药对防治AD提供实验依据。材料与方法1.应用TCMSP(中药系统药理学数据库和分析平台,https://***/***)和BATMAN数据库(中药分子机制的生物信息学分析工具,http://***/bat man-tcm/),预测熟地黄、山茱萸药效物质基础及其相应的作用靶标;应用BATMAN数据库,预测熟地、山茱萸的药效物质基础和有效成分;利用TTD(Therapeutic target database,http://***/ttd/)、GAD(http://***/)、TCM SP等数据库,对AD的作用靶标进行筛选;运用Cytoscape软件,构建“熟地黄-山茱萸药效物质基础-AD病理作用靶标的网络模型,揭示其在AD病理过程中的作用。在DAVID数据库中,通过GO注释及KEGG Pathway分析“熟地黄-山茱萸药效物质-AD病理作用靶标,获得与AD病理作用密切关联的KEGG Pathway。通过上述研究,阐明地黄-山茱萸配伍对抗AD的可能途径。2.以Aβ25-35(20μmol/L)处理N2a细胞构建AD细胞模型,给予低、高浓度的熟地黄-山茱萸醇提物作用24 h。采用CCK8法测定细胞存活率,寻求最佳的Aβ25-35的诱导浓度;Hoechst 33342和Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡;比色法和Western blot法分别检测含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)活性及蛋白表达;Western blot法检测p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT蛋白表达。结果1.筛选出熟地黄-山茱萸药对共41个活性成分,其中最终有效成分熟地黄4个,山茱萸20个;熟地黄-山茱萸的活性成分不仅调节人前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、毒蕈碱型胆碱受体M1(CHRM1)、毒蕈碱型胆碱受体M2(CHRM2)等10个靶标,还影响44个生物过程(例如乙酰胆碱受体活性、乙酰胆碱酯酶活性、胆碱酯酶活性、G蛋白偶联血清素受体活性、酶结合和血清素结合)和6条代谢途径(钙信号通路和胆碱能突触信号通路等)。根据网络药理学实验,并结合文献报道与AD的相关性,我们选取PI3K-AKT信号通路作为熟地黄-山茱萸药对改善AD神经细胞损伤进行后续实验研究。2.与空白对照组相比,经过Aβ25-35处理后的N2a细胞凋亡率显著升高,Caspase-3相对活性和蛋白表达下降,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值下降(P0.05);给予低、高浓度的熟地黄-山茱萸醇提物作用24 h后,N2a细胞的凋亡率降低,Caspase-3活性及Cleaved caspase-3蛋白表达下降,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值升高,与模型组比较差异有统计学意义(P0.05);与低剂量组比,高剂量组N2a细胞的凋亡率和Caspase-3相对活性降低,p-AKT/AKT比值升高(P0.05)。结论通过网络药理学研究了熟地黄-山茱萸药对发挥抗AD作用的药效物质基础及作用机制,预测到干预AD的作用靶点与信号通路,并选取PI3K-AKT信号通路作为目标通路进行细胞实验验证。采用细胞模型实验证明熟地黄-山茱萸醇提物对Aβ25-35诱导的AD细胞损伤模型具有抗凋亡作用,作用机制可能与其激活PI3K-AKT信号通路抑制Capases-3活性及蛋白表达相关。