烟酰胺磷酸核糖转移酶在创伤性脑损伤中的作用及机制研究

作     者：黄曦雯 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王汉东

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：创伤性脑损伤 烟酰胺磷酸核糖转移酶 自噬 凋亡 

摘      要：研究背景:创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)是世界各地人群死亡和残疾的主要原因,目前尚无针对TBI有效的治疗方法和策略,因此,深入研究TBI的致病机制,对寻找新的治疗策略、改善TBI患者神经功能具有重大意义。烟酰胺磷酸核糖转移酶(Niacinamide phosphoribose transferase,Nampt)是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸循环生物合成途径中的关键酶。研究表明Nampt特异性激动剂P7C3-A20具有抗凋亡活性,对成年小鼠海马中新生神经前体细胞及神经元具有强大的神经保护特性。但Nampt在TBI后的作用及其可能的机制尚不明确。神经元自噬和凋亡是TBI后继发性脑损伤的重要发病机制。因此,本研究的目的是探索Nampt激活能否在TBI后通过神经元自噬,减少神经元凋亡发挥神经保护作用,并阐明其具体机制。方法:为探究Nampt在TBI后变化情况,我们首先在体内及体外TBI模型中检测伤后不同时间点Nampt的表达情况。我们将成年雄性ICR小鼠,随机分组,小鼠根据不同时间点分为创伤后6 h、12 h、24 h、3d、5 d、7 d组,运用自由落体法建立TBI模型。体外实验采用细胞划痕模型,根据时间点不同分为以下几组:Sham,3 h,6 h,12 h及24 h。通过Western blot技术检测TBI后不同时间点小鼠伤灶附近脑组织及体外细胞模型中Nampt表达水平的变化。然后我们进行Namp的干预实验:将实验动物随机分为假手术组(Sham),TBI组,TBI+安慰剂组(TBI+V),TBI+A20组。在伤后24h对各组小鼠进行神经功能评分和测量脑组织水肿情况。体外实验将永久化小鼠海马神经元细胞系(HT22)随机分为对照组(Sham),划痕组(scratch),划痕+安慰剂组(scratch+V),划痕+给药组(scratch+A20),用Kit-8(CCK-8)和LDH活性试剂盒检测细胞活性。为了验证激活Nampt的神经保护作用是否与细胞自噬有关,我们将小鼠及HT22细胞随机分组同上4组。采用免疫荧光、Western blot、Nissl染色、电镜和TUNEL染色等方法检测自噬及凋亡相关指标。通过Western blot检验自噬相关蛋白(p-mTOR、mTOR、p-S6K1、S6K1、TSC2、p-TSC2、Sirt-1),探究Nampt激活通过调控TSC2/mTOR/S6K1通路诱导自噬增强的分子机制。结果:Nampt在TBI后的大脑皮层和经划痕处理的HT22神经元中表达量呈先下降再缓慢升高的趋势。体内试验中,与Sham组相比,Nampt蛋白表达在伤后24 h达到最低值。体外试验中,与Sham组相比,Nampt蛋白表达在划痕损伤6h达到最低值。免疫组化和免疫荧光染色显示,Nampt在神经元的细胞质和细胞核中表达,主要集中在细胞核中。激活Nampt可缓解TBI引起的神经功能损伤、颅内水肿和神经元变性。Western blot检验及TUNEL染色等结果提示,激活Nampt可缓解TBI体内及体外模型的细胞凋亡。在TBI体内体外模型中,与TBI组相比,TBI+A20组自噬相关蛋白明显升高,同时p-mTOR/mTOR和p-S6K1/S6K1的比率相对于Sham组明显提高,TBI+A20组则降低,p-TSC2、Sirt-1的蛋白表达降低,给药处理后其表达显著增高,提示Nampt的激活可通过调控TSC2/mTOR/S6K1通路活化自噬来保护神经元。结论:TBI后激活Nampt可能通过增强自噬来减少TBI后的神经元凋亡,产生神经保护作用,该作用或许与调控TSC2/mTOR/S6K1通路有关。