越南伯克霍尔德氏菌C12突变体库的构建及acpT基因功能研究

作     者：曹帅 

作者单位：长江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙正祥

授予年度：2023年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 

主      题：伯克霍尔德氏菌 Tn5转座子 Occidiofungin PPTase 生防机制 

摘      要：从野地瓜(Ficus tikoua Bur.)中分离得到的越南伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)C12菌株对多种植物病原体表现出明显的抑菌活性。本研究使用质粒p SC123构建随机突变文库,以立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)为指标筛选抑菌活性缺失突变体,通过反向PCR扩增被转座子插入基因的侧翼序列,与全基因组进行比对确定相关基因并进行生物信息学分析与功能验证,研究其关键抑菌活性物质与拮抗机制,主要结果如下:利用Tn5转座子对伯克霍尔德氏菌C12进行随机插入突变,构建了5000个突变体,筛选出12个拮抗能力明显下降的转化子,其中C12＿5765、C12＿5772、C12＿5768、C12＿5771、C12＿5761、C12＿5764这6个基因编码的蛋白质与参与occidiofungin(ocf)的生物合成的NRPS具有序列高度一致性。Tn5-4218突变体对立枯丝核菌也几乎没有抑制作用,该acpT基因编码的多肽与Sfp型磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶具有高度序列一致性,这种类型的酶是通过将辅酶A的磷酸泛酰巯基乙胺基部分转移到NRPS的硫化结构域来激活NRPS的。Tn5-3685、Tn5-4341和Tn5-2794三个突变株的Tn5转座子均插入至C12＿2629,其活性显著降低但未完全丧失,该基因编码乳酸脱氢酶。经比较基因组学分析和基因功能注释,菌株C12的关键抑菌物质ocf合成基因簇中含有ORF1-18共18个重要的合成调控基因,与菌株B.pyrrocinia Lyc2的amb R1-2、ocf A-N基因相似性为68.0%-96.0%。编码PPTase的acpT基因功能研究:对acpT基因进行了基因敲除和回补,构建了acpT基因的突变体和回补体。菌株C12、ΔacpT及ΔacpT-com对水稻纹枯病菌平板抑菌活性测定,抑菌率分别为76.45%、4.82%和75.45%,对盆栽防效分别为77.79%、12.36%和76.58%,说明突变体的抑菌效果显著下降,回补菌株ΔacpT-com与野生菌株C12相比无显著性差异,该基因的功能得到恢复。蛋白酶检测,ΔacpT不产生蛋白酶,acpT基因影响菌株C12的产胞外蛋白酶能力。嗜铁素检测,ΔacpT不产生黄色晕圈,嗜铁素定量检测菌株C12、ΔacpT和ΔacpT-com含量分别为72.30%、11.91%和69.52%,菌株C12和ΔacpT-com均显著高于ΔacpT,该基因影响菌株C12的产嗜铁素的能力。HPLC分析显示突变体ΔacpT在5.5-8.0min抑菌物质峰值缺失,说明突变体不产生抑菌活性物质。荧光定量检测ocf合成基因表达量,突变体ΔacpT中正调控因子ocf D、ocf E、ocf H和ocf J的表达量相对于野生型明显下调,acpT基因在ocf合成调控基因的表达过程中发挥了重要作用。