染色质结构与转录因子调控机制及其在疾病中的作用研究
作者单位：军事科学院
学位级别：硕士
导师姓名：伯晓晨
授予年度：2023年
学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100104[医学-病理学与病理生理学] 10[医学]
摘 要：研究背景染色质结构是指由DNA缠绕组蛋白并在细胞核内盘曲折叠形成的空间三维结构,包含了染色质开放性、空间构象等。转录因子是一类能够结合DNA并影响基因表达的蛋白,部分转录因子在发挥调控功能的过程中牵引染色质形成空间结构,同时染色质结构也会影响转录因子与DNA结合。染色质结构与转录因子的动态调控在细胞复制、修复和转录调控中发挥重要作用。目前,随着染色质构象捕获和染色质免疫沉淀后测序技术日趋成熟,多组学数据库逐步建立,基于不同数据来源的研究算法快速兴起,为研究不同条件下染色质结构与转录因子的调控机制带来新的机遇。问题和挑战哺乳动物细胞核中,染色质结构与转录因子调控关系复杂、调控机制尚未明确。目前,染色质结构与转录因子调控的机制解析缺乏系统化的研究算法与不同条件下的数据来源,成为限制染色质结构与转录因子研究的关键瓶颈。染色质结构与转录因子研究需要海量的测序数据与复杂的分析和实验验证,具有成本高、周期长的特点,当下缺乏高效准确的研究算法为数据产生提供引导指向,因此大量转录因子对染色质结构的影响未知。同时,研究算法是否接近调控本质,需要不同条件数据来源对算法进行验证和完善,由于缺乏对癌症转移与新冠感染组织的染色质结构研究,因此染色质结构与转录因子在两种条件下的调控机制未知。两大制约因素相互影响,共同阻碍了染色质结构与转录因子调控机制解析。研究目的针对目前研究中,大量转录因子对染色质结构影响未知,我们通过开发识别影响染色质结构转录因子的系统性筛选算法,形成新的研究范式,促进更多影响染色质结构的转录因子发现与解析;其次,针对染色质结构与转录因子在癌症转移和新冠感染组织中调控机制研究不充分的现状,我们研究结直肠癌原发和转移过程中染色质结构改变和新冠病毒感染中转录因子与染色质开放性的调控机制,为染色质结构与转录因子研究分析算法提供新的数据来源。研究内容首先开发影响染色质结构的转录因子识别方法,并对筛选得到的转录因子进行RNA干扰验证,揭示新型转录因子调控染色质结构规律;其次探究染色质结构在结直肠癌的癌旁、原发和转移样本中的变化规律,揭示染色质易位改变三维结构、调控基因表达变化的内在机制;最后探究染色质开放性与转录因子在新冠病毒感染中的动态调控规律,揭示新冠病毒受体蛋白ACE2表达的调控机制。研究方法1.基于人类基因组DNA元件百科全书(ENCODE)计划中高质量染色质免疫共沉淀(Ch IP-seq)测序数据,开发染色质结构相关转录因子筛选算法,量化候选转录因子与先验染色质结构相关蛋白的共定位水平。接着通过小分子RNA干扰(si RNA)实验沉默候选基因SIX5,通过高通量染色质构象捕获技术(Hi-C)分析沉默后染色质结构的改变。最后,利用靶向切割并标记实验(CUT&Tag)对SIX5和已知染色质结构调控转录因子ZNF143的相互作用模式进行探究,揭示转录因子SIX5与ZNF143协同维持染色质构象的内在机制。2.染色质结构在结直肠癌中的变化规律研究选取了课题组与首钢医院合作获取的6名发生转移患者的癌旁、原发灶和转移癌样本以及7名未发生转移患者的癌旁和原发灶样本。首先对多组学数据严格质控,筛选高质量数据。接着根据转录组(RNA-seq)数据,分析结直肠癌发生转移的特异表达模式。进一步基于Hi-C数据与基因表达关联,分析染色质结构在结直肠癌发生和转移过程中A/B区室(A/B compartment)和拓扑关联结构域(TAD)层面的改变对基因表达调控的影响。最后应用基于Hi-C的染色质易位识别算法,揭示染色质易位对染色质结构的影响规律。3.新冠病毒感染细胞模型采用课题组已验证的ACE2启动子区染色质开放且易感的Caco-2细胞系(人结肠癌细胞系)和ACE2启动子区染色质不开放且不易感的A549细胞系(人非小细胞肺癌细胞系)。为了探究染色质开放对转录因子结合的影响,首先对两个细胞系进行I型干扰素(IFN-α)处理,诱导ACE2过表达,利用RNA-seq与蛋白质印迹法(Western Blot)对比诱导前后ACE2表达与翻译情况。接着用ATAC-seq与q PCR实验确认诱导后ACE2的启动子开放性并未受影响。进一步选取ACE2启动子区富集的转录因子HNF1A,运用CUT&Tag与q PCR实验观察HNF1A的结合情况。最后,构建转录因子调控网络与蛋白互作网络,分析新冠病毒感染相关通路。研究结果1.开发了影响染色质结构的转录因子识别方法,探究了新型染色质结构相关转录因子SIX5对染色质结构的调控机制。结果发现:染色质结构相关转录因子识别算法在不同的细胞系中均得到SIX5;筛选得到的转录因子SIX5显著富集在高层级的TAD边界,调控抑癌与DNA修复基因RMI2;SIX5与ZNF143沉默其中一个转录因子将影响另一转录因子与DNA结合,并且沉默后染色质结构发
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