白藜芦醇通过DLC1-DYRK1A-EGFR轴介导的DNA损伤诱导癌细胞衰老

作     者：马凤秋 

作者单位：山东师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李国荣

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：白藜芦醇 癌细胞衰老 DNA损伤 DLC1 DYRK1A-EGFR轴 

摘      要：细胞衰老是一种不可逆的细胞周期停滞状态,可由端粒损伤、DNA损伤、氧化应激等多种因素触发,通过诱导癌细胞衰老来抑制癌细胞增殖被认为是一种新的抗癌策略。DLC1是一种肿瘤抑制基因,在多种癌症中经常失活或表达下调。研究表明DLC1通过抑制癌细胞增殖和迁移、诱导癌细胞凋亡来发挥抑癌作用,但关于DLC1诱导癌细胞衰老的研究较少。致癌基因EGFR过表达与癌症患者的不良预后密切相关,DLC1通过靶向抑制EGFR阻止癌症进展。此外,研究显示EGFR与调节激酶DYRK1A的表达呈正相关,DYRK1A-EGFR轴的失活介导了p53诱导的癌细胞衰老。我们推测DLC1和DYRK1A-EGFR轴之间可能存在某种调控关系。白藜芦醇是一种天然多酚,在预防和阻止癌症进展方面发挥着重要作用,可通过上调DLC1和促进DNA损伤诱导癌细胞衰老,但关于DLC1与DNA损伤的关系尚未有文献报道。因此,本论文探讨白藜芦醇是否通过DLC1调控DYRK1A-EGFR轴介导DNA损伤来诱导癌细胞衰老。首先,我们通过MTT和克隆形成实验检测了白藜芦醇对癌细胞增殖的影响。将人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7、人肝癌细胞系Hep G2以及人正常肝细胞系WRL68用不同浓度的白藜芦醇处理24 h后进行MTT实验,结果显示:白藜芦醇以剂量依赖的方式抑制了癌细胞增殖,并在100μM时达到半抑制浓度(IC50),而其对正常肝细胞增殖的影响较小。将这三种癌细胞暴露于10或20μM白藜芦醇10 d后进行克隆形成实验,结果显示:白藜芦醇以剂量依赖的方式减少了癌细胞克隆形成的数量。SA-β-gal活性的增强是衰老细胞的一个重要特征,SA-β-gal染色实验结果显示:20μM白藜芦醇处理7 d或100μM白藜芦醇处理24 h均显著增加了三种癌细胞中SA-β-gal阳性细胞的比例。通过western blotting实验我们对其他衰老标志物p53、p21和Lamin B进行了检测,结果显示:100μM白藜芦醇处理24 h增加了癌细胞中p53和p21的表达,减少了Lamin B的表达。为了缩短实验周期,后续实验我们均采用100μM白藜芦醇处理24 h来探究白藜芦醇诱导癌细胞衰老的机制。我们通过western blotting和免疫荧光染色实验检测了白藜芦醇对癌细胞DNA损伤的影响,结果显示:白藜芦醇显著增加了癌细胞中DNA损伤蛋白γH2AX的表达和核聚集,减少了DNA修复相关蛋白RAD51和p-BRCA1的表达。为了探究白藜芦醇是否通过调控DLC1诱导癌细胞DNA损伤,我们进行了western blotting实验,结果显示:白藜芦醇显著上调了MDA-MB-231、MCF-7和Hep G2癌细胞中DLC1的表达,在MCF-7细胞中,敲低DLC1减弱了白藜芦醇诱导的癌细胞衰老,过表达DLC1显著上调了γH2AX、下调了p-BRCA1和RAD51的蛋白水平,说明白藜芦醇通过上调DLC1促进DNA损伤从而诱导癌细胞衰老。同时,白藜芦醇显著抑制了MDA-MB-231、MCF-7和Hep G2癌细胞中DYRK1A和EGFR的表达。在MCF-7细胞中,敲低DYRK1A后,EGFR表达减少,使用EGFR抑制剂Erlotinib处理MDA-MB-231和MCF-7细胞24 h后,γH2AX表达升高,p-BRCA1和RAD51表达降低,SA-β-gal活性增强,表明白藜芦醇通过负调控DYRK1A-EGFR轴促进DNA损伤从而诱导癌细胞衰老。我们进一步探究DLC1与DYRK1A-EGFR轴间的调控关系,结果显示:在MCF-7细胞中,敲低DLC1减弱了白藜芦醇对DYRK1A-EGFR轴的抑制作用,而过表达DLC1抑制了DYRK1A-EGFR轴的激活,说明DLC1负调控DYRK1A-EGFR轴。氧化应激也可导致DNA损伤从而促进癌细胞衰老,实验结果显示:白藜芦醇显著升高了MDA-MB-231、MCF-7和Hep G2癌细胞中ROS的水平,使用ROS清除剂NAC处理MCF-7和Hep G2细胞后,白藜芦醇诱导的DNA损伤和癌细胞衰老受到抑制。我们之前的研究显示,外源性添加HO上调了癌细胞中DLC1的m RNA水平,我们推测ROS可能对DLC1及其下游DYRK1A-EGFR轴有影响。western blotting实验结果显示:在MCF-7细胞中,加入NAC减弱了白藜芦醇对DLC1的激活和对DYRK1A-EGFR轴的抑制作用,表明ROS可以调控DLC1-DYRK1A-EGFR轴。最后,我们通过鸡胚尿囊膜异种移植瘤模型检测了白藜芦醇对体内肿瘤生长的影响,结果显示:与对照组相比,0.5 m M或1 m M白藜芦醇处理MCF-7细胞异种移植瘤6 d后,移植瘤体积明显减小。为了探究白藜芦醇抑制体内肿瘤生长的机制,我们将形成的