苹果蜡质合成相关基因MdLACS1的克隆和功能鉴定

作     者：李娇娇 

作者单位：山东农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李媛媛

授予年度：2023年

学科分类：09[农学] 0902[农学-园艺学] 090201[农学-果树学] 

主      题：苹果 表皮蜡质 长链酰基辅酶A合成酶1 胁迫抗性 

摘      要：表皮蜡质是位于植物最外层疏水结构,主要由脂类化合物比如烷烃类、醇类、酮类、醛类、酯类、脂肪酸类等物质组成。蜡质在采前既能作为天然的保护层反射多余的紫外线防止植物被晒伤;又能防止水分过度蒸发,起到保水的作用;还能降低植物表面润湿性,减少病原菌的附着。因此苹果果皮蜡质积累量增多可以提高采后贮藏品质,延长货架期,提高苹果的商品价值。植物表皮蜡质合成过程中,C16:0和C18:0短链脂肪酸在长链酰基辅酶A合成酶(Long-chain Acyl Co A synthetases,LACSs)作用下形成蜡质合成的前体。之后在脂肪酸延伸酶催化下生成VLCFAs。VLCFAs经过醇合成途径和烷烃合成途径生成VLCFAs衍生物,如脂肪醛、烷烃、脂肪醇、酮和酯质等,由此可见LACSs基因在参与植物蜡质合成过程有十分重要的作用。尽管LACSs基因已在拟南芥中进行了广泛的研究,但其在苹果中的进化机制和功能,仍不够清晰。本研究通过对苹果长链酰基辅酶A合成酶1(Long-chain Acyl Co A synthetase 1,LACS1)的功能鉴定,发现其具有促进蜡质合成,抵御非生物胁迫和生物胁迫的能力。相关研究结果如下:1.MdLACS1促进表皮蜡质累积。检测MdLACS1在苹果根、茎、叶、花、果皮和果肉不同组织的表达水平发现Md LACS1在果皮的表达水平最高。通过基因瞬时表达的方法提高Md LACS1在苹果果皮的表达水平,并使用扫描电子显微镜发现Md LACS1促进了苹果果皮蜡质积累。为进一步验证Md LACS1在促进蜡质合成的功能获得了Md LACS1异源表达拟南芥,通过提取蜡质、GC-MS分析蜡质成分和扫描电子显微镜观察结果都显示Md LACS1促进了表皮蜡质积累。将Md LACS1异源表达的拟南芥进行叶绿素浸出实验和叶片失水实验,发现Md LACS1异源表达拟南芥茎和叶片的表皮通透性降低。2.MdLACS1增强植物的抗旱性。使用6%PEG6000处理野生型‘王林’苹果愈伤组织、Md LACS1转基因愈伤组织和anti Md LACS1愈伤组织,发现Md LACS1提高了愈伤组织的抗渗透胁迫能力。干旱处理野生型拟南芥和Md LACS1异源表达拟南芥,结果发现Md LACS1异源表达拟南芥抗旱能力明显增强。3.MdLACS1增强植物的抗盐性。对野生型苹果愈伤组织、MdLACS1转基因愈伤组织和anti Md LACS1转基因愈伤组织进行150 m M Na Cl处理,Md LACS1提高了愈伤组织的抗盐性。150 m M Na Cl处理野生型拟南芥和Md LACS1异源表达拟南芥进一步证明转基因植株提高了对盐胁迫的抗性。4.Md LACS1增强植物的抗病性。对野生型愈伤组织、Md LACS1转基因愈伤组织、和anti Md LACS1转基因愈伤组织接种B.dothidea,菌丝在Md LACS1转基因愈伤表面蔓延速度最慢,在anti Md LACS1转基因愈伤组织表面蔓延速度较快,q RT-PCR结果显示Md LACS1转基因愈伤组织中抗病相关基因表达水平升高。对Md LACS1异源表达拟南芥和野生型拟南芥注射Pst DC3000病菌,发现转基因植株蜡质增多后阻碍病菌进入植株体内,Md LACS1异源表达拟南芥叶片变黄程度低于野生型拟南芥,表现出较强的抗病菌能力。实验结果证明Md LACS1通过改变内源免疫基因表达水平和促进蜡质合成增强植物抗病性。