牙周菌群的胞外囊泡在牙周炎进程中的作用及机制研究

作     者：施璐瑶 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：何於娟

授予年度：2023年

学科分类：1003[医学-口腔医学] 100302[医学-口腔临床医学] 10[医学] 

主      题：牙周炎 牙周菌群 细菌胞外囊泡 牙龈上皮屏障 

摘      要：目的探究人口腔牙周菌群产生的胞外囊泡在牙周炎发展过程中的作用和分子机制。方法1.收集牙周炎患者和健康对照者的龈沟液(gingival crevicμLar fluid,GCF)分别进行细菌有氧和厌氧培养,实验分组:牙周炎患者厌氧菌组(Anaerobic EV in periodontitis patients,P-An-EV)和需氧菌组(Aerobic EV in periodontitis patients,P-Ae-EV),正常人厌氧菌组(Anaerobic EV in normal subjects,N-An-EV)和需氧菌组(Aerobic EV in normal subjects,N-Ae-EV),采用超速离心法提取细菌胞外囊泡后,透射电镜、NTA粒径分析和考马斯亮蓝染色对其大小、形态及外膜蛋白进行初步差异分析。2.采用CCK8实验和流式细胞技术检测胞外囊泡对牙龈上皮Ca9-22细胞增殖和凋亡的影响,检测牙龈上皮细胞跨膜电阻值、葡聚糖渗透率,以探究不同胞外囊泡对牙龈上皮屏障的影响,最后用Western blot、免疫荧光染色验证胞外囊泡对上皮细胞紧密连接蛋白的影响。3.采用丝线结扎法建立小鼠牙周炎模型,结扎10天后,去除丝线,继续牙龈注射不同类型的胞外囊泡7天,Western blot、q PCR检测牙龈组织中紧密连接蛋白的表达,HE染色和q PCR评估牙龈炎症情况,TRAP染色和Micro-CT评估牙槽骨损伤的程度,验证胞外囊泡对小鼠牙周炎进程的影响。采用16S测序评估胞外囊泡处理对小鼠口腔菌群的影响4.采用多粘菌素B(Polymyxin B,PMB)中和胞外囊泡的LPS后处理牙龈上皮细胞,通过跨膜电阻值、FD4渗透率、Western blot、q PCR和免疫荧光染色验证胞外囊泡携带的LPS在牙龈上皮屏障损伤中的作用。5.通过牙龈注射胞外囊泡模拟牙周致病菌胞外囊泡在体内的散播,活体成像观察胞外囊泡到达深层组织和器官的时间进程,牙周炎与肠道疾病的相关性结果1.透射电镜和NTA粒径分析显示P-An-EV比N-An-EV粒径大,而P-Ae-EV和N-Ae-EV粒径大小无显著差异,但考马斯亮蓝染色显示各组的蛋白组分存在差异。***、FD4、Western blot和IF结果提示仅P-An-EV可以破坏牙龈上皮屏障并降低紧密连接蛋白的表达,其余各组均无明显作用。3.小鼠体内实验结果显示:与空白组和N-An-EV组比较,P-An-EV显著降低牙龈组织中紧密连接蛋白的表达,诱导口腔菌群失调,加重牙龈炎症和牙槽骨的丢失。*** blot、IF等结果显示PMB中和P-An-EV携带的LPS以后,P-An-EV对上皮屏障的破坏下降,表明P-An-EV携带的LPS在牙周炎进程中发挥了重要作用。5.活体成像结果显示牙周细菌胞外囊泡很容易从口腔进入肠道。进一步采用P-An-EV处理肠上皮细胞后发现紧密连接蛋白表达降低,提示进入肠道的P-An-EV可能对肠道上皮屏障产生一定的影响。结论P-An-EV破坏上皮屏障和细胞间紧密连接,诱导口腔菌群失调,加重牙龈炎症和牙槽骨吸收,促进牙周炎的发生发展。