竹节参皂苷Ⅳa抗糖尿病心肌病的药效研究及其纳米制剂的制备与评价

作     者：吴忻晶 

作者单位：中国人民解放军空军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：关月

授予年度：2020年

学科分类：100702[医学-药剂学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：C-Ⅳa 糖尿病心肌病 能量代谢 SIRT3 脂质-聚合物杂化纳米粒 

摘      要：【背景】糖尿病(Diabetes mellitus,DM)已成为全世界范围内最常见的慢性病之一,发病率逐年攀升。糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是DM相关的严重并发症之一,指患者在没有高血压、冠心病或瓣膜性心脏病等情况下而出现的左心室肥厚和舒张期舒张异常,增加诸如心律不齐和心源性猝死等重大死亡风险。DCM是由复杂的病理生理因素引起的,包括代谢异常、氧化应激、炎症和心血管自主神经病变等。大量研究表明,心肌能量代谢异常和线粒体功能障碍在DCM的发生发展中至关重要。生活方式的改变、降糖、降脂治疗和心衰管理是目前DCM的主要治疗策略。由于这些干预的临床疗效并不理想,寻找防治DCM的新靶点和新药物具有重要的临床意义。竹节参皂苷Ⅳa(Chikusetsu saponinⅣa,C-Ⅳa)具有心脏保护、脑保护、降糖、降脂、抗炎、抗凝血以及抗肿瘤等多种药理活性。本课题组前期研究表明,C-Ⅳa心脏保护疗效确切,减轻糖尿病诱导的心肌损伤,但具体机制尚不清楚。故本研究拟从整体、细胞、分子水平揭示C-Ⅳa调节能量代谢改善DCM的机制。此外,由于C-Ⅳa不易透过生物膜,口服吸收慢、消除快,口服剂量大等,一定程度上限制了药效的发挥,因此我们对C-Ⅳa制剂进行了初步探索。基于纳米技术,制备了荷载C-Ⅳa的脂质-聚合物杂化纳米粒(Lipid-polymer hybrid nanoparticles as a carrier of Chikusetsu saponinⅣa,C-Ⅳa/LPNs),旨在提高C-Ⅳa的抗DCM心肌损伤疗效,为C-Ⅳa的临床应用奠定理论基础。【目的】1.明确C-Ⅳa通过调节能量代谢改善DCM;2.阐明C-Ⅳa通过激活去乙酰化酶3(Sirtuin3,SIRT3),抑制线粒体通透性转换孔(Mitochondrial permeability transition pore,m PTP)开放,从而调节能量代谢,改善DCM;3.制备C-Ⅳa/LPNs,提升C-Ⅳa抗DCM心肌损伤作用。【方法】1.C-Ⅳa通过调节能量代谢改善DCM的药效研究:将野生型(Wild type,WT)C57BL/6小鼠随机分为5组:对照组(Control)、DCM模型组、C-Ⅳa各剂量组(30、60、120mg/kg)。通过腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)建立小鼠DCM模型。每两周监测血糖和体重的变化;多道生理记录仪监测心功能指标;计算心脏重量与体重比(the radio of heart weight to body weight,HW/BW);苏木精-伊红(Hematoxylin and eosin,HE)染色观察心肌组织病理;通过试剂盒检测心肌组织羟脯氨酸(Hydroxyproline,Hydro)、I型胶原蛋白(Collagen I,Col I)和三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)含量;酶标仪上连续观察线粒体吸光度变化监测m PTP开放;Western Blot检测SIRT3、Bcl-2、Bax、Caspase 3等蛋白表达。体外试验采用高糖(High glucose,HG)诱导H9c2细胞损伤模型,观察不同剂量(10、20、40μM)C-Ⅳa预处理对H9c2细胞的保护作用。MTT法检测细胞生长情况;测定心肌细胞乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)活力、ATP含量、线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,ΔΨm);流式细胞术测定细胞凋亡率;Western Blot检测SIRT3表达。2.C-Ⅳa通过激活SIRT3调节能量代谢的机制研究:通过质粒转染构建SIRT3过表达(Overexpressed,OE)的H9c2细胞,然后建立HG诱导H9c2细胞模型。比较C-Ⅳa预处理对SIRT3 OE的H9c2细胞和正常H9c2细胞的抗HG损伤作用。MTT法观察细胞生长情况;检测细胞上清液中LDH活力;流式细胞术考察细胞凋亡;激光共聚焦观察ΔΨm、m PTP开放。在小鼠DCM模型中,进一步比较C-Ⅳa对SIRT3基因敲除小鼠和WT小鼠心肌能量代谢、线粒体功能的保护作用。通过透射电镜观察心肌线粒体结构;检测心肌组织ATP含量和m PTP开放;Western Blot检测线粒体能量代谢相关蛋白表达水平。3.C-Ⅳa/LPNs纳米制剂的制备及评估:采用正交试验优选C-Ⅳa/LPNs的处方;使用纳米沉淀法制备;透射电镜法观察其物理形态和均一性,检测粒径和Zeta电位;超滤法测定C-Ⅳa/LPNs的包封率(Encapsulation efficiency,EE)和载药量(Drug loading ratio,DL),体外模