钒氯过氧化酶催化氨基酸合成腈类化合物的应用研究

作     者：张瑞瑞 

作者单位：石河子大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘雯霞;李瑞峰

授予年度：2023年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 100701[医学-药物化学] 

主      题：钒氯过氧化物酶 氨基酸 腈类化合物 

摘      要：目的:(1)通过文献查阅和数据库调研挖掘出能够催化氨基酸合成腈类化合物的广谱酶,并实现其在工业微生物菌大肠杆菌中的高效异源表达;(2)通过优化工程菌株的培养条件来提高钒氯过氧化酶(VCPO)的表达量和催化活性,并探究VCPO的酶学性质以找出其最佳催化条件;(3)通过研究VCPO作用于不同底物时对应的产物谱,确定该酶的广谱性,并确认最佳底物,纯化该底物的产物。方法:(1)使用分子生物学技术构建质粒p ET28a-VCPO,进一步筛选出VCPO的表达菌株,根据VCPO的粗酶使酚红水溶液颜色变化深浅来初步判断酶的活性。(2)通过调节诱导温度、诱导时间和诱导剂浓度优化VCPO表达菌培养条件,同时使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯基酰胺凝胶蛋白电泳(SDS-PAGE)检测酶的表达情况,使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。对影响酶活性质的溴化钠浓度、补加过氧化氢的时间、pH和温度进行分析,确定VCPO的最佳反应条件。(3)初步测试VCPO对L-高丝氨酸,L-丙氨酸、L-酪氨酸、L-异亮氨酸、L-色氨酸,L-谷氨酸,L-天冬氨酸和L-2-氨基丁酸的催化活性,使用高效液相色谱(HPLC)检测对应的腈化物来确定VCPO的最佳底物,并对该反应产物进行分离纯化。结果:(1)通过筛选确定了VCPO的最佳表达菌株,根据VCPO蛋白溶液与酚红水溶液反应的结果,初步证明该酶有活性。(2)在诱导剂IPTG添加量为1 m M,诱导温度为20℃,诱导时间为20 h时蛋白表达量最高为12.72 mg/mL,总酶活最高为0.42 U。酶学活性分析表明该酶在溴化钠浓度为10 m M、每5 min补加5 m M的过氧化氢、pH=5.6、25℃下VCPO催化L-高丝氨酸生成3-羟基丙腈的活性最好,由此确定了该酶的最佳催化条件。(3)通过对VCPO的底物谱进行拓展,用HPLC对它们的产物进行检测,发现1.272 mg/mL的VCPO对底物浓度为50 m M的L-高丝氨酸的转化率最高为58.32%,并以L-高丝氨酸为底物在实验室制备得到1.11 g/L纯度为68.37%药物中间体3-羟基丙腈。结论:通过筛选确定了来自海洋生物的VCPO的表达载体和表达宿主菌,并成功实现了VCPO在工业微生物大肠杆菌中的异源表达;通过优化得到最佳诱导条件为诱导剂IPTG浓度为1 m M,诱导温度为20℃,诱导时间为20 h,最佳反应条件为溴化钠浓度10 m M、pH=5.6、每5 min加入5 m M过氧化氢、温度为25℃;在此反应条件下得到浓度为1.11 g/L,纯度为68.37%的药物中间体3-羟基丙腈。为酶法催化氨基酸合成腈类化合物在工业上的应用提供参考依据。