LncRNA TUG1/miR-449a-5p/Caspase-3轴在棕榈酸诱导的HT-22细胞损伤中的调控作用及其部分机制研究

作     者：韦亚东 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：葛金芳

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：LncRNA TUG1 miR-449a-5p 棕榈酸 凋亡 突触可塑性调节 

摘      要：2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是糖尿病的主要临床类型,并常诱发或伴发以认知功能障碍为主要表现的神经精神行为改变。流行病学资料显示,T2DM增加了患者认知功能降低的风险。因而,探索T2DM神经精神损伤的发生机制并开发有效治疗药物是神经精神领域的重要研究方向之一。糖脂代谢障碍是导致T2DM病情进展的主要原因,而高血脂症被认为是导致T2DM认知功能损伤的独立危险因素。本课题组前期研究结果表明,高脂刺激可能是导致T2DM状态下神经精神损伤的主要原因,但具体的机制有待进一步探究。近年来,对长链非编码RNA(Lnc RNAs)功能的研究不断深入。牛磺酸上调基因Lnc RNA TUG1是最早发现的与人类疾病相关的基因之一,可通过调控细胞增殖、分化和凋亡等生物学过程参与帕金森、癫痫等多种神经系统疾病的发生发展过程,对糖脂代谢也存在一定的调控作用。本研究拟首先观察并确证高脂饮食诱导的T2DM小鼠海马组织中Lnc RNA TUG1的丰度改变及其与T2DM小鼠学习记忆能力下降之间的关联,在此基础上建立高棕榈酸诱导的HT-22细胞损伤模型,并借助基因干预技术,系统观察Lnc RNA TUG1丰度改变对脂质过氧化、细胞凋亡和突触可塑性的影响,以期深入研究Lnc RNA TUG1在T2DM神经精神损伤中的作用及其可能机制。目的观察Lnc RNA TUG1在高脂刺激诱导的HT-22细胞损伤中的作用并探讨其可能的分子机制。方法1.高脂饮食联合链脲佐菌素腹腔注射构建T2DM小鼠模型,基因测序法观察T2DM与正常组小鼠海马组织Lnc RNAs的差异表达并进行GO分析和KEGG富集分析,q RT-PCR方法验证Lnc RNA TUG1及其他6个差异表达最为显著的Lnc RNAs及的表达水平。2.体外培养HT-22细胞,梯度浓度棕榈酸刺激,MTT及LDH释放率实验确定实验条件。模型确证后,形态学观察结合MTT及LDH释放实验检测细胞损伤程度,q RT-PCR方法验证Lnc RNA TUG1表达水平。Western Blotting方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Cleaved-Caspase-3,突触可塑性调节关键蛋白Synapsin-1、Synaptotagmin-1以及脑源性神经营养因子BDNF,Akt/GSK-3β信号通路相关蛋白Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β的表达。在此基础上,采用si RNA干扰技术降低HT-22细胞Lnc RNA TUG1的表达水平,设置对照组(C)、模型组(M)、模型+阴性对照组(M+NC),模型+si RNA组(M+si RNA),正常+阴性对照组(C+NC)和正常+si RNA组(M+si RNA)。LDH检测HT-22细胞损伤作用,Western Blotting方法与流式细胞术实验方法共同检测HT-22凋亡水平,Western Blotting方法检测突触可塑性调节关键蛋白及Akt/GSK-3β信号通路的改变,化学发光法和ELISA方法分别检测脂质过氧化指标MDA、LPO、GSH/GSSG和4-HNE水平,免疫荧光法检测氧化应激指标ROS水平。3.在此基础上,根据生物信息学软件预测Lnc RNA TUG1参与调控的ce RNA网络,确定下游调控的mi RNA,q RT-PCR方法和双荧光素酶报告基因法进行验证。实验分别设置对照组(C)、模型组(M)、模型+阴性对照组(M+NC),模型+Mimics组(M+Mimics),正常+阴性对照组(C+NC),正常+Mimics组(C+Mimics),模型+Inhibitor组(M+Inhibitor)和正常+Inhibitor组(C+Inhibitor),分别探索升高或降低mi R-449a-5p表达水平对PA刺激诱导的HT-22细胞损伤的调控作用。LDH检测HT-22细胞损伤作用,Western Blotting与流式细胞术检测细胞凋亡水平,Western Blotting方法检测突触可塑性调节关键蛋白及Akt/GSK-3β信号通路的改变,化学发光法和ELISA方法分别检测脂质过氧化指标MDA、LPO、GSH/GSSG和4-HNE水平,免疫荧光法检测氧化应激指标ROS水平。生物信息学软件预测mi R-449a-5p可能结合的m RNA,接着借助q RT-PCR方法以作分析论证。结果1.和对照组相比,T2DM组小鼠海马中共检测出141个表达上调的Lnc RNAs和136个表达下调的Lnc RNAs,q RT-PCR结果与芯片筛选结果一致。GO和KEGG富集分析结果显示,差异表达的Lnc RNAs主要集中在代谢、生长发育过程、细胞信号转导等几个方面。与对照组比较,在2型糖尿病小鼠海马组织和高脂诱导的HT-22细胞中Lnc RNA