ABL2调控柯萨奇B3病毒复制的机制研究

作     者：谯晓容 

作者单位：江苏大学 

学位级别：硕士

导师姓名：申红星

授予年度：2023年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

主      题：柯萨奇病毒B3 肠道病毒 ABL2 致病机制 

摘      要：背景及目的:柯萨奇病毒B3（Coxsackievirus B3,CVB3）是一种常见的单正链RNA病毒,其感染会导致多种疾病,如心肌炎、胰腺炎和脑炎等,但目前其致病机制尚不清楚。酪氨酸激酶2（ABL proto-oncogene 2,ABL2）是非受体酪氨酸蛋白激酶家族成员之一,参与调节细胞的增殖、形态和细胞黏附等多种生理过程。最近研究报道,ABL2参与病原微生物的感染过程,但其在CVB3感染复制的作用尚不清楚。因此,本研究主要以ABL2为研究对象,探讨其对CVB3复制的影响及其调控机制,旨在阐明CVB3感染复制的分子机制,为临床诊治CVB3感染诱导的疾病提供理论基础依据和药物靶点。方法:1.选用He La作为经典CVB3感染细胞模型,通过Western blot分析CVB3以感染复数（MOI）为1、5、10感染细胞后,ABL2的表达差异。2.使用慢病毒分别构建稳定过表达ABL2和沉默ABL2的He La细胞,并使用Western blot和q RT-PCR进行验证。CVB3分别感染稳定过表达和沉默ABL2的He La细胞株,用Western blot实验检测CVB3衣壳蛋白VP1的表达情况、病毒噬斑实验分析病毒滴度变化、CVB3-e GFP荧光病毒分析ABL2对CVB3复制的影响。3.用ABL2抑制剂（Imatinb）和CCK-8实验分析ABL2对CVB3复制周期的影响,使用不同浓度Imatinb处理He La细胞,感染CVB3后不同时间收取细胞蛋白和上清液,采用Western blot、病毒噬斑实验和TCID方法分析CVB3的复制。4.利用STING网站预测、结合免疫共沉淀（Co-IP）、Western blot和免疫荧光实验分析ABL2的互作蛋白。再进一步使用Western blot和病毒噬斑实验方法分析ABL2互作蛋白对CVB3复制及相关信号通路的影响。5.使用Western blot分析CVB3感染中ABL2过表达/沉默对互作蛋白和相关信号通路的调控。再使用ABL2和互作蛋白共表达实验分析二者对CVB3复制及相关信号通路的影响。结果:***3以不同MOI感染He La细胞,ABL2表达均出现下降;在MOI=5时,ABL2的下降最为显著。2.在构建的稳定过表达和沉默ABL2的He La细胞株上,过表达ABL2可显著抑制CVB3衣壳蛋白VP1的表达,减少病毒滴度和CVB3-e GFP的荧光强度;而沉默ABL2,则促进CVB3 VP1的表达,增加病毒滴度和荧光病毒的荧光强度。3.在CVB3感染不同时间加入ABL2抑制剂,Western blot和病毒噬斑实验分析表明ABL2可抑制CVB3感染早期阶段。***-IP和细胞免疫荧光共定位实验发现ABL2和RAC1存在互作关系。CVB3感染He La细胞后,RAC1表达上调。过表达RAC1可促进VP1的表达,并增加病毒滴度和CVB3-e GFP荧光病毒数量,并且增加PI3K、AKT的磷酸化;沉默RAC1则使VP1的表达下降,病毒滴度下降,荧光病毒数量减少,PI3K、AKT的磷酸化被抑制。5.过表达ABL2后,RAC1的表达下降,检测p-PI3K和p-AKT信号通路也呈下降趋势;沉默ABL2后感染CVB3,RAC1的表达量显著上升,PI3K和AKT的磷酸化水平也增加。ABL2和RAC1共表达分析进一步表明ABL2互作RAC1后调控PI3K和AKT信号通路抑制CVB3的感染复制。结论:ABL2作为CVB3感染过程中的抗病毒基因,可通过负调控其互作基因RAC1的表达、PI3K/AKT信号通路等多种途径抑制CVB3复制,有望为临床诊治CVB3感染提供新的思路。