抗新生血管生成肽EA的硫酸软骨素化修饰及其稳定性、抗血管新生与抗肿瘤作用及机制研究
作者单位：山东大学
学位级别：硕士
导师姓名：谭海宁
授予年度：2023年
学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学]
摘 要：近年来,癌症死亡率逐步升高,且呈现出低龄化趋势,使人类生命健康受到严重威胁。研究发现,肿瘤的生长和转移与肿瘤附近新生血管的生成有密切关系。抑制血管生成阻断肿瘤的血液供给,进而抑制肿瘤的生长和转移,是治疗实体肿瘤的有效方法之一。ES2-AF(EA)是一种通过固相合成方式获得的抗新生血管生成肽,前期研究表明,其可高效抑制内皮细胞增殖和迁移,但存在半衰期短、稳定性差等缺点。为了解决这些问题,拟对EA进行化学修饰。硫酸软骨素(Chondroitin sulfate,CS)是一种内源性多糖,具有良好的生物相容性和可降解性。同时,它对肿瘤表面过表达的CD44蛋白有高度亲和力,能够靶向肿瘤细胞。因此,本课题采用CS对EA进行修饰,得到了 CS-ES2-AF(CS-EA)聚合物。前期研究表明,CS-EA比EA具有更长的半衰期和更好的肿瘤靶向能力,但其稳定性、抗血管新生与抗肿瘤作用及机制仍有待研究。在前期研究基础上,本论文围绕上述未解问题开展研究,主要内容和取得结果如下:***-EA的制备采用固相合成的方法将AF肽和ES2肽进行融合,成功制备了分子量为2254.53的EA多肽,纯度为96.30%。使用四丁基氢氧化铵修饰CS,获得易溶于二甲基亚砜(DMSO)的CS衍生物,并在卡特缩合试剂(BOP)和催化剂N,N-二异丙基乙铵(DIPEA)的作用下,以酰胺键的形式将CS与多肽EA偶联获得糖肽结合物CS-EA。***-EA稳定性和抑制内皮细胞增殖作用研究通过CCK-8试剂盒检测,结果表明,在25℃和37℃条件下,EA和CS-EA的生物活性随着孵育时间的延长而降低,25℃条件下的稳定性优于37℃;在4℃冰箱储存的过程中,两种药物保留的生物活性随着时间的延长呈现缓慢下降的趋势,30天后,仍保留70%以上的活性;不同pH孵育后两种药物的活性大幅度下降,CS-EA能在更加广泛的pH范围内保留更多的生物活性;在稳定性研究中,CS-EA的稳定性始终都优于EA。EA、EA&CS和CS-EA均有抑制内皮细胞增殖的作用,且抑制能力呈浓度依赖性,其中以CS-EA抑制能力为最佳。***-EA在内皮细胞中的摄取和摄取途径的研究通过流式细胞仪和激光共聚焦检测内皮细胞对CS-EA的摄取机制。结果显示,与CS偶联后的EA,更易进入细胞,其摄取能力具有时间依赖性。另外,EA和CS-EA都是经过网格蛋白和脂筏途径入胞。***-EA促内皮细胞凋亡机理的研究以EAhy 926细胞为研究对象,通过线粒体膜电位、活性氧、凋亡、周期等实验研究CS-EA促内皮细胞凋亡的作用机制。结果表明,CS-EA能下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量,从而引起线粒体膜电位下降,进而导致线粒体解联呼吸链,产生过量活性氧(ROS)。ROS氧化线粒体内膜的心磷脂导致Cyto-c释放,进而激活Caspase 3,通过线粒体凋亡通路来诱导内皮细胞凋亡。此外,CS-EA还能使内皮细胞阻滞在G1期,减少内皮细胞的分裂和增殖。通过下调血管生成相关蛋白VEGF和CD31的表达量,抑制新生血管的生成,进一步抑制内皮细胞的增殖和迁移。***-EA体内抗肿瘤作用研究构建小鼠B16黑色素瘤模型,研究EA、EA&CS、CS-EA对肿瘤的抑制作用。结果表明,三种药物都能抑制小鼠体内黑色素瘤的增长,且经CS修饰后EA的抑瘤率显著提高,CS-EA组抑瘤率为68.79%。在连续给药十四天后,各组小鼠体重均有所增加,但未出现明显毒副作用。对小鼠的心、肝、脾、肺、肾进行HE染色分析,结果表明各组脏器细胞形态正常。免疫荧光检测肿瘤组织中部分凋亡和血管生成因子表达,结果表明,三种药物均能上调Caspase 3、Cyto-c表达量,降低Bcl-2、VEGF和CD31表达量。综上所述,经CS修饰后EA的稳定性和抗新生血管生成活性显著提高,CS-EA具有抑制黑色素瘤生长的效果,并且安全性良好,小鼠不会产生明显的毒副反应。本研究为新生血管生成相关疾病的药物开发奠定了理论基础。
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