血流感染高毒力肺炎克雷伯菌的临床感染特征、分子分型及获得碳青霉烯耐药基因后适应性差异研究

作     者：杭修兵 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘周

授予年度：2023年

学科分类：1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 10[医学] 

主      题：高毒力肺炎克雷伯菌 碳青霉烯耐药 分子流行病学 适应性代价 转录组分析 

摘      要：目的:探讨血流感染肺炎克雷伯菌（KPN）的临床感染特征、耐药现状以及分子生物学特点。分析ST23型高毒力肺炎克雷伯菌（hv KP）分别获得KPC和NDM型碳青霉烯耐药基因后的生物学差异、毒力变化,初步探讨构建株碳青霉烯耐药hv KP（CR-hv KP）的适应性特征及基因表达水平差异。方法:（1）收集2019年06月-2022年10月血流感染患者的非重复KPN菌株及临床资料,排除病史资料不全和两种及以上细菌混合感染,最终本研究共纳入240株KPN菌株。应用Microflex LT型质谱仪进行菌种鉴定,Vitek-2分析仪进行药敏试验,通过毒力基因类型将KPN分为hv KP组及普通KPN（c KP）组。分析血流感染KPN的耐药现状,筛选主要耐药基因携带情况。应用多位点序列分型（MLST）及荚膜多糖血清分型（wzi）分析KPN各ST型的亲缘关系。（2）挑选携带p LVPK-like毒力质粒的ST23K1型hv KP作为亲代（KP54798）,将其进行全基因组测序,分析质粒携带情况,确证为ST23K1型且携带p LVPK-like质粒。将重组耐药质粒p ACYC-184KPC(p AKPC)和p ACYC-184NDM(p ANDM)导入亲代菌株中,构建CR-hv KP菌株(KP54798-p AKPC和KP54798-p ANDM)。利用药敏试验、拉丝实验、生物膜形成实验及荚膜多糖抗原定量实验对亲代KP54798、构建株KP54798-p AKPC和KP54798-p ANDM的生物学特征进行分析。通过共培养竞争试验、生长动力学曲线和质粒稳定性试验比较其适应性代价。采用血清杀菌试验和大蜡螟感染模型比较三者毒力变化,采用RNA转录组测序对其进行基因转录组水平分析。结果:（1）本研究共纳入240株KPN菌株,hv KP总体检出率为44.2%,以社区感染为主,占64.2%,30～60岁之间的青壮年多发,占53.8%;主要分布在感染科（30.2%）与重症监护室（14.2%）。c KP检出率为55.8%,以医院感染为主,占76.9%,主要集中在60岁以上老年人,占56.7%;主要临床分布为重症监护室（14.2%）和急诊科（14.2%）。药敏结果显示:hv KP和c KP对碳青霉烯类药物的耐药率分别为13.2%和20.1%;其中hv KP检出以ST23型（38.7%）为主,Goe BURST分析显示,hv KP组中ST23为克隆群主型,wzi分型以K1为主;c KP以ST11型（20.1%）为主,wzi分型以K64型（19.4%）为主;CR-hv KP中分为ST11（78.6%）和ST23（21.4%）。常见耐药基因分析:c KP中5种耐药基因bla KPC、bla NDM、bla IMP、bla OXA-48和bla VIM的检出率分别为16.4%、4.5%、1.5%、0.7%和0;在hv KP中,仅检出耐药基因bla KPC（11.3%）和bla NDM（0.9%）,分别占CR-hv KP的92.3%和7.7%。毒力基因方面,hv KP检出率均高于75%。,c KP组检出率除mrk D和kfu外,其他均低于40%。（2）临床菌株KP54798的基因组由一条基因组长度为5420844 bp的染色体和一个分子量大小为225890 bp的质粒组成。表型验证确定CR-hv KP菌株构建成功,构建株耐药性明显增加。抗生素压力筛选出耐碳青霉烯变异株后,发现KPC阳性株携带外源质粒稳定,连续传代72h后携带率为92.3±0.58%,而NDM阳性株连续传代72h后携带率仅为42.0±2.65%。构建株CR-hv KP在生长速率、生物膜形成能力以及毒力方面均有不同程度的下降。全转录组测序显示KPC阳性株下调的功能基因涉及荚膜异多糖酸代谢,而NDM株未见明显下调,同时上调的功能基因集中在生物合成方面。与亲代相比,KPC阳性株毒力基因rmp A、rmp A2、iuc A及iro B表达水平下调,荚膜多糖结构基因man C、wza、wzb表达水平下调,相关调控基因Rcs A/B表达水平下调（P0.05）。结论:（1）本院hv KP总体检出率为44.2%,以ST23K1型为主,毒力基因检出率较高,且检出ST23K1型CR-hv KP。（2）KPC型CR-hv KP携带外源质粒稳定,但出现了明显的高黏表型减弱、毒力降低等适应性改变,而NDM型CR-hv KP高黏表型和毒力稍有减弱,但质粒携带不稳定。KPC型CR-hv KP在主要毒力基因、荚膜多糖结构及相关调控基因表达水平上出现了下降趋势,其适应性代价表征可能与上述基因表达下调相关;同时,导入外源性质粒后构建株CR-hv KP的整体基因表达发生了改变使其生理特征发生变化。