基于电化学DNA传感器的赭曲霉毒素A检测研究

作     者：冯贝贝 

作者单位：河南工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：金华丽;卫敏;乔青青

授予年度：2023年

学科分类：081704[工学-应用化学] 07[理学] 080202[工学-机械电子工程] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学] 0802[工学-机械工程] 

主      题：赭曲霉毒素A 核酸适配体 滚环扩增技术 DNAzyme 金纳米线 DNA纳米花 DNA-银纳米簇 双模传感器 

摘      要：目前,关于真菌毒素污染食品问题受到了全球范围内的广泛关注。其中赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是一种由青霉和曲霉产生的次级代谢产物,严重威胁到人体健康和食品安全。因此,亟需建立一种灵敏的检测方法对OTA进行检测。电化学核酸适配体法,是一种将电化学与核酸适配体相结合的方法,具有操作简单、特异性好、易于现场检测等优势。本课题借助滚环扩增技术(RCA)、DNAzyme、金纳米线(Au NWs)、DNA纳米花、银纳米簇(Ag NCs)信号放大策略,设计三种新颖的电化学适配体传感器对OTA的检测进行研究。具体内容如下:1、基于OTA介导DNA环形探针的形成,进而触发RCA反应协助Ag-DNAzyme扩增作为信号放大策略,设计一种信号减小型电化学适配体传感器。该传感器以亚甲基蓝(MB)为信号标签,当不存在OTA时,无法触发DNA环形探针的形成,进而无法触发RCA反应,因此无法生成Ag-DNAzyme裂解带有r A位点的MB标记的发夹DNA(HP-MB),导致初始电流(I)很大;当OTA存在时,触发DNA环形探针的形成,进而触发RCA反应,生成带有重复Ag-DNAzyme序列的长链DNA裂解HP-MB,导致MB电信号(I)下降,最终通过MB信号响应检测OTA。凝胶电泳表征结果验证了RCA反应的成功进行。对实验条件进行优化,得到C:C最优比为10:1,C:C:C的最佳比为1:1:1,RCA最佳反应时间为60 min,Phi29聚合酶的最佳用量为5 U。在上述最优条件下,传感器在5×10ng/m L～50 ng/m L的范围内,(I-I)/I与Lg C具有较好的线性关系,检出限为38 fg/m L。同时,传感器在实际样品玉米粉和红酒的检测中也展现出较好的结果,平均回收率分别为86.2%～113.0%和116%～121%。另外,该传感器也展现出较高的特异性、可接受的重复性、重现性以及稳定性。2、设计一种以Au NWs为电极修饰材料、以RCA反应诱导生成含有适配体和MB的双功能DNA纳米花作为识别单元和信号标签用于OTA的检测研究。当OTA不存在时,无法在电极表面形成三明治复合结构,导致出现较小的MB电流;当OTA存在时,双功能DNA纳米花与电极表面的适配体、OTA形成三明治复合结构,导致电极表面出现较高的MB信号,最终通过MB信号的变化实现对OTA的检测。通过对比Au NWs修饰前后的电活性表面积,结果显示修饰后的电活性表面积增加了0.34倍。另外,对Au NWs修饰前后的传感器进行电化学测量验证,当使用MB和OTA浓度分别为8 m M和1 ng/m L时,未修饰Au NWs时的MB电流为5.9μA,而修饰后的MB电流为9.7μA,信号增加了0.64倍,表明Au NWs对加速电极表面电子转移有显著作用。对DNA纳米花进行SEM、TEM和凝胶电泳表征,结果表明DNA纳米花的成功制备。通过对影响传感器性能的条件探究,在最优条件下电流值与Lg C在1×10ng/m L～10 ng/m L的范围内展现出较好的线性关系,检出限为1.12 fg/m L。对加标的小麦粉和油茶豆样品进行检测研究,其平均回收率分别为96.6%～98.1%和99%～113%。对HPLC法处理的OTA玉米粉质控样进行检测,并采用SPSS软件对检验结果进行t检验分析,在95%置信区间内,OTA玉米粉1和OTA玉米粉2的p值分别为0.677和0.36,均大于0.05,说明本方法与HPLC差异不显著,表明所制备的传感器检测结果准确。另外,传感器也展现出较好的特异性、稳定性、重现性和重复性。3、经前期研究发现,电化学核酸适配体法在实际应用中能实现对OTA的高灵敏检测。然而,大多数传感器集中在单一模式的输出信号,不能抵消操作条件、生物环境及其他因素的影响,因此不可避免地出现假阳性结果。相比之下,双模式策略不仅为实际检测需求提供了多种方法,还可以通过两种模式的相互验证,实现结果的定量测定,进一步提高传感器的可靠性。因此,本章基于易制备且具有双重信号性质的DNA-Ag NCs结合磁分离技术设计了一种简单、灵敏的电化学-荧光双模传感器。以DNA-Ag NCs为荧光和电化学信号探针,当不存在OTA时,体系中无法合成DNA-Ag NCs探针,导致体系中出现较低的荧光和电化学信号;当OTA存在时,导致巯基修饰且富含胞嘧啶DNA(C-DNA)的脱落,经磁分离取上清后与加入的硝酸银(Ag NO)及硼氢化钠(Na BH)反应,形成DNA-Ag NCs探针,出现较高的荧光和电化学信号,最终通过对荧光和电化学的信号响应实现对OTA的双模检测。通过对Ag NCs进行TEM和高分辨率TEM表征,结果表明Ag NCs的成功生成。对实验条件进行优化,得到MBs的最佳用量为2.5μL,OTA孵育的最佳时间为3