两个坏死和乙烯诱导蛋白（NLP）同源蛋白与球孢白僵菌侵染致病的关系

作     者：余晨熙 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张永军

授予年度：2021年

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 09[农学] 0904[农学-植物保护] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

主      题：球孢白僵菌 坏死和乙烯诱导蛋白 昆虫免疫反应 

摘      要：坏死和乙烯诱导蛋白(necrosis and ethylene-inducing peptide-1(NEP1))like proteins(NLP)作为一类植物病原菌的病原相关分子模式,可以引起植物的免疫反应。毒性NLP可以导致植物组织坏死,而非毒性NLP可以引起植物强烈的免疫反应。NLP依据蛋白序列和系统发育可以分为I型、II型和III型。除植物病原真菌外,昆虫病原真菌及其它真菌是否存在NLP蛋白尚无报道。本文以重要的昆虫病原真菌球孢白僵菌(Beauveria bassiana)为研究材料,通过NLP特有的NPP1结构域搜索基因组筛选获得2个NLP同源蛋白,结合表达分析、基因敲除、过表达与体外表达等策略探究NLP与病原菌侵染致病的关系,进而采用蛋白互作技术,筛选NLP作用于昆虫的靶标蛋白,为揭示NLP的作用机制奠定基础。主要研究结果如下:***1与BbNLP2序列结构分析及系统进化分析以NLP蛋白特有的NPP1结构域搜索真菌基因组,发现NLP蛋白普遍存在于丝状真菌中,其中球孢白僵菌基因组存在两个NLP蛋白编码基因,BBA＿01257和BBA＿01679。两个NLP蛋白在氨基酸序列N-端均存在典型的信号肽序列,包含NLP家族蛋白共有的保守NPP1结构域和形成二硫键的保守半胱氨酸残基。BBA＿01257编码255个氨基酸残基,相对分子量为28 k Da,等电点为5.03,命名为BbNLP1。BBA＿01679编码283个氨基酸残基,相对分子量为31 k Da,等电点为6.23,命名为BbNLP2。系统进化分析表明,BbNLP1和BbNLP2分别为II型和III型NLP。由此推测BbNLP1和BbNLP2可能存在不同的进化关系。***1和BbNLP2基因表达特性分析和蛋白分泌特性利用qRT-PCR分析BbNLP1和BbNLP2在不同形态和不同营养条件下的表达特性,发现两个基因在不同形态细胞中均表达,其中BbNLP1在芽生孢子形态的表达水平显著高于分生孢子、菌丝(气生和液生)和虫菌体,而BbNLP2在菌丝的表达水平高于其他细胞形态。在不同营养条件下两基因均表达,但BbNLP1在昆虫血淋巴诱导条件下的表达水平显著高于在营养培养基培养条件和昆虫体壁诱导条件,而BbNLP2在基础培养基培养条件下表达水平略高于其它营养条件。融合基因启动子和GFP进行荧光观察与RT-q PCR结果一致。由此推测,BbNLP1和BbNLP2可能参与病原菌正常生长与发育分化,但作用可能存在差异,其中BbNLP1可能与昆虫血腔营养利用或病原菌与宿主互作相关。为探究两个蛋白的细胞分布和分泌特性,分别将两个基因编码区或去除信号肽序列的编码区与GFP融合,置于组成型启动子下游构建融合基因表达菌株。结果表明,缺失信号肽序列的融合基因,在液体培养菌丝胞内均检测到较强的荧光信号,而包含信号肽的融合基因菌丝荧光信号弱。收集后者培养液分泌蛋白,利用GFP抗体和Western杂交检测,发现在培养液中均检测到两个融合蛋白。由此表明BbNLP1和BbNLP2可分泌至胞外基质。***1和BbNLP2均与菌株侵染致病和宿主血腔免疫反应相关为探究BbNLP1和BbNLP2与菌株侵染致病的关系,分别获得了基因敲除、回复互补、过表达菌株和双超量表达菌株。研究发现,破坏和超量表达BbNLP1和BbNLP2不影响菌株生长发育及分生孢子产生与萌发。生物测定结果显示,破坏BbNLP1和BbNLP2不影响菌株毒力,但BbNLP1和BbNLP1/2毒力显著高于野生菌株,而超量表达BbNLP2则导致菌株毒力下降。由此推测,两个BbNLP蛋白对球孢白僵菌侵染致病具有不同的作用。为检测BbNLP蛋白与昆虫免疫反应的关系,在真菌侵染过程中测定了酚氧化酶活性。结果显示,微量注射接种BbNLP1、BbNLP2和BbNLP1/2分生孢子均显著激活昆虫酚氧化酶活性,而接种ΔBbNLP1、ΔBbNLP2的昆虫酚氧化酶活性与野生型菌株处理无明显差异。由此推测,超量表达BbNLP1和BbNLP2干扰了昆虫体内的免疫反应。为进一步明确BbNLP1和BbNLP2与免疫反应的关系,利用毕赤酵母表达BbNLP1和BbNLP2,纯化后注射至大蜡螟血腔。发现纯化蛋白可以引起昆虫血细胞凝集反应,相对于对照组血细胞数量显著减少,酚氧化酶活性显著提升。由此证明,BbNLP1和BbNLP2均可激活昆虫免疫反应。***1和BbNLP2作用于昆虫的肽聚糖识别蛋白为探究BbNLP1和BbNLP2参与昆虫免疫反应的机制,分别接种组成型表达菌株至昆虫血腔24 h,利用免疫共沉淀分离两个蛋白可能作用昆虫的靶标蛋白,并采用酵母双杂交筛选互作蛋白。结果发现,BbNLP1与昆虫两个肽聚糖识别蛋白具有直接互作,而BbNLP2与另一个肽