抗坏血酸过氧化物酶在响应玉米小斑病抗性中的研究

作     者：赵阳涛 

作者单位：河南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吴刘记

授予年度：2023年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 

主      题：玉米 小斑病 抗坏血酸过氧化物酶 H2O2 茉莉酸 

摘      要：玉米是我国第一大粮食作物,在保障我国粮食安全中具有重要的战略地位。但是近年来,随着全球气候变暖、耕作和种植制度的改变,玉米病害在生产中呈现出越来越严重的发生趋势,严重降低了玉米的产量和品质。玉米小斑病是生产中发生的一种重要的叶部病害,在世界范围内广泛发生,给玉米生产带来严峻的挑战。挖掘玉米小斑病抗性资源,解析其抗性机制,进而培育抗性品种,是解决这一问题的重要途径。课题组前期鉴定到了一个定位于小斑病抗性QTL区间内编码抗坏血酸过氧化物还原酶的基因,研究结果暗示了其与玉米小斑病抗性相关。本研究在前期研究的基础上,通过对抗坏血酸过氧化物酶基因在小斑病抗病自交系和感病自交系中的表达分析,对抗坏血酸过氧化物酶在玉米小斑病抗性中的功能进行了初步分析。进一步筛选鉴定了抗坏血酸过氧化物酶的突变体材料,并对该突变体进行了抗病性鉴定,证实了抗坏血酸过氧化物酶在玉米小斑病抗性中的重要功能。最后,利用细胞学和分子生物学等手段,初步解析了抗坏血酸过氧化物酶在玉米小斑病中的抗性机制。主要研究结果如下:1.通过qRT-PCR的方法测定了抗坏血酸过氧化物酶基因在抗病自交系Mo17及感病自交系B73中的表达情况。结果表明在未接种小斑病病原玉蜀黍平脐蠕孢菌时,Mo17和B73中抗坏血酸过氧化物酶的表达水平不存在显著差异,但是在接种玉蜀黍平脐蠕孢菌后,Mo17中抗坏血酸过氧化物酶的表达水平显著高于B73,上述结果暗示了抗坏血酸过氧化物酶在玉米小斑病抗性中的正向调控作用。2.对申请得到的2个Mu转座子插入材料,mu1043915和mu1046680进行田间种植,通过PCR的方法筛选鉴定了抗坏血酸过氧化物酶的纯合突变体,进一步通过qRT-PCR和Western blot分别研究了纯合突变体和野生型株系中抗坏血酸过氧化物酶基因的相对表达量和抗坏血酸过氧化物酶蛋白的表达丰度。结果表明在纯合突变体中抗坏血酸过氧化物酶基因的表达量显著低于野生型,抗坏血酸过氧化物酶蛋白的表达量也明显少于野生型,说明筛选鉴定到的抗坏血酸过氧化物酶突变体可以用于后续实验。3.进一步对抗坏血酸过氧化物酶纯合突变体和野生型株系进行了小斑病抗性鉴定,结果表明纯合突变体对玉米小斑病的抗性显著低于野生型。通过石蜡切片的方法研究了纯合突变体和野生型在接种玉蜀黍平脐蠕孢菌后的细胞学差异,结果显示在接种玉蜀黍平脐蠕孢菌后,纯合突变体中的菌丝数量要明显的多于野生型,细胞的破坏程度也要明显的比野生型严重。该结果进一步证明了抗坏血酸过氧化物酶在玉米小斑病抗性中的功能。4.通过DAB染色和HO检测试剂盒测定了抗坏血酸过氧化物酶纯合突变体和野生型在接种玉蜀黍平脐蠕孢菌后的HO积累情况。结果显示,在接种后不同的取样时间点,纯合突变体中的HO含量均要高于相应的野生型。进一步对小斑病抗病自交系Mo17和感病自交系B73在接种玉蜀黍平脐蠕孢菌后的HO含量进行测定,发现抗病自交系Mo17中的HO含量显著低于感病自交系B73。这些结果表明抗坏血酸过氧化物酶可能通过降低HO水平来增强玉米对小斑病的抗性。5.最后利用酶联免疫试剂盒测定了抗坏血酸过氧化物酶纯合突变体和野生型在接种玉蜀黍平脐蠕孢菌后防御相关激素JA、SA积累情况。结果显示纯合突变体在接种玉蜀黍平脐蠕孢菌后JA的含量显著低于野生型,而SA的含量和野生型相比没有显著差异,表明抗坏血酸过氧化物酶并不显著影响玉米体内SA的含量变化,但可以促进显著JA的积累。进一步通过qRT-PCR的方法测定了JA、SA合成及响应相关基因的表达量,结果发现在纯合突变体中,JA合成及响应相关基因的表达量显著低于野生型,而SA响应相关基因的表达量和野生型相比则没有显著差异。以上结果表明抗坏血酸过氧化物酶可能通过JA介导的信号通路调控玉米对小斑病的抗性。综上所述,本研究成功鉴定到了抗坏血酸过氧化物酶的纯合突变体,并利用该突变体进一步研究了抗坏血酸过氧化物酶在玉米小斑病抗性中的功能,发现抗坏血酸过氧化物酶可以降低HO的积累,提高JA含量以及参与JA信号通路来增强玉米对小斑病的抗性。这些研究结果明确了抗坏血酸过氧化物酶在玉米小斑病抗性中的功能及初步抗性机制,拓宽了抗坏血酸过氧化物酶在植物抗病中的研究,为玉米抗病育种提供了新的抗性资源。