基于斑马鱼模型的丹参素异丙酯安全性评价和抗缺氧作用机制研究

作     者：张思岳 

作者单位：齐鲁工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘可春

授予年度：2023年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：丹参素异丙酯 安全性评价 抗缺氧 斑马鱼 作用机制 

摘      要：目的:丹参素异丙酯是复方丹参方在机体内的核心代谢物质,在体外细胞模型上,具有抗缺氧、抗炎、抗氧化、舒张血管和抗心肌缺血、保护心肌细胞的作用。为了验证其在整体动物模型上是否具有相同作用,我们利用模式生物斑马鱼进行丹参素异丙酯抗缺氧活性的评价和作用机制的研究。为了确定丹参素异丙酯在斑马鱼模型上的安全浓度,更好地开展抗缺氧活性和作用机制研究,我们对丹参素异丙酯进行了系统地安全性评价研究。方法:1、利用斑马鱼模型对丹参素异丙酯进行安全性评价,确定丹参素异丙酯的安全浓度,系统评价丹参素异丙酯对斑马鱼心脏、肝脏、肾脏和发育的影响。2、利用斑马鱼模型考察丹参素异丙酯的抗缺氧活性,分别以丹参素异丙酯对缺氧损伤斑马鱼的死亡率、整体形态、多巴胺神经元、脑部血管、运动行为和氧化应激的影响为评价指标,评价丹参素异丙酯的抗缺氧损伤活性。3、通过转录组测序预测丹参素异丙酯发挥抗缺氧损伤作用的相关信号通路,利用Real time qPCR检测信号通路相关基因的表达水平,并利用分子对接技术分析丹参素异丙酯与相关靶点蛋白的结合方式和结合活性。通过考察丹参素异丙酯对缺氧损伤斑马鱼体内炎症细胞、凋亡细胞数量及活性氧含量的影响评价丹参素异丙酯的抗炎和抗氧化能力,利用Real time qPCR检测炎症和氧化应激相关基因的表达水平,同时利用分子对接技术对丹参素异丙酯与相关靶点蛋白的结合活性进行验证,以此来阐明丹参素异丙酯的抗缺氧损伤作用机制。结果:1、实验结果发现,低浓度丹参素异丙酯(1.0 mM及以下浓度)对斑马鱼幼鱼影响较小或无影响。高浓度丹参素异丙酯对斑马鱼幼鱼具有毒性,引起斑马鱼组织脏器形态及功能受损。丹参素异丙酯的半数致死浓度(LC)为2.83 mM、10%致死浓度(LC)为1.99 mM和最小致死浓度(LC)为1.49 mM。基于此结果,我们选用了0.5、1.0和2.0 mM作为后续安全性评价实验的工作浓度。实验结果发现,在丹参素异丙酯浓度为2 mM时,斑马鱼幼鱼心率显著降低,肝脏出现萎缩、边界模糊、颜色加深等畸形,肝脏相对荧光面积和相对荧光强度显著降低。与空白组相比,丹参素异丙酯各给药组斑马鱼体侧及眼部无水肿现象,表明各浓度丹参素异丙酯对斑马鱼肾脏无影响。在研究丹参素异丙酯对斑马鱼发育的影响时,结果发现丹参素异丙酯1.0 mM和2.0 mM组斑马鱼发育迟缓,胚胎未孵化完全,且已孵化的幼鱼出现轻微心包水肿。随着暴露时间的延长,斑马鱼出现体型弯曲、鱼鳔缺失、肝脏萎缩等畸形。丹参素异丙酯2.0 mM组斑马鱼畸形和死亡程度严重。2、与空白组相比,缺氧组和丹参素异丙酯给药组斑马鱼幼鱼整体形态及各组织器官并无差异,各组也均未出现斑马鱼死亡情况。与空白组相比,缺氧组斑马鱼多巴胺神经元相对长度显著降低。与缺氧组相比,丹参素异丙酯200μM组斑马鱼多巴胺神经元相对长度显著增加。与空白组相比,缺氧组斑马鱼脑部血管受到损伤,数量减少,经丹参素异丙酯给药后,脑部血管数量明显增加。与空白组相比,缺氧组斑马鱼游动行为能力下降,游动总距离和平均速度降低。丹参素异丙酯则改善了缺氧诱导斑马鱼的游动行为能力降低,与缺氧组相比,丹参素异丙酯处理组斑马鱼的游动距离和平均速度有所增加。与空白组相比,缺氧组斑马鱼体内谷胱甘肽含量降低,丹参素异丙酯100和200μM组斑马鱼谷胱甘肽含量显著增加。与空白组相比,缺氧组斑马鱼丙二醛含量有上升趋势,经丹参素异丙酯给药后有下降趋势,但无显著性差异。3、转录组测序结果发现,与缺氧组相比,丹参素异丙酯50μM组生物过程富集程度较高的GO条目有蛋白质水解、趋化因子介导的信号通路、创伤的炎症反应、中性粒细胞趋化性等。丹参素异丙酯100μM组富集程度较高的生物过程条目有中性粒细胞趋化性、趋化因子介导的信号通路、免疫反应和炎症反应。丹参素异丙酯200μM组富集程度较高的生物过程为中性粒细胞趋化性、趋化性、对细菌的反应、趋化因子介导的信号通路和免疫反应。通过KEGG通路富集分析发现,四个对比组共同富集到了神经活性配体-受体相互作用信号通路。我们选取了神经活性配体-受体相互作用信号通路中的关键基因进行Real time qPCR验证,结果发现丹参素异丙酯可以调控该通路基因的异常表达。同时我们也选取了部分靶点蛋白如F2RL1、NPY1R、PTGER2与丹参素异丙酯进行分子对接,发现丹参素异丙酯与这些靶点蛋白具有良好的结合活性。通过对转录组测序结果的分析,我们猜测丹参素异丙酯可能通过神经活性配体-受体相互作用信号通路参与体内炎症和氧化应激的调节,因此我们检测了丹参素异丙酯对缺氧损伤斑马鱼体内炎症细胞迁移数量、凋亡细胞数量及活性氧含量的影响,结果发现丹参素异丙酯降低了缺氧损伤斑马鱼体内的炎症细胞、凋亡细胞和活性氧含量。我们选取了与炎症和氧化应激相关的基因进行Real time qPCR检测其表达量的变化,发现丹参素异丙酯可以调控相关基因的异常表达。同时分子对接结果也表明丹参素异丙酯与相关靶点蛋白如CXCL8、HSP70.1和PRKCEB等有良好的结合活性。结论:1、丹参素异丙酯对斑马鱼的毒性较小。低浓度丹参素异丙酯(1.0 mM及以下浓度)对斑马鱼的整体形态及各组织器官的影响较小或无影响,高浓度丹参素异丙酯(2.0 mM及以上浓度)对斑马鱼具有毒性,引起斑马鱼脏器形态及功能受损。提示我们在临床应用中要注意控制丹参素异丙酯的用量。2、对缺氧损伤斑马鱼给予不同浓度的丹参素异丙酯进行治疗,发现丹参素异丙酯能逆转缺氧引起的斑马鱼损伤,如提高多巴胺神经元相对长度、增加脑部血管数量、通过增加斑马鱼游动距离和平均速度缓解斑马鱼运动行为损伤等。3、丹参素异丙酯可能通过神经活性配体-受体相互作用通路参与体内炎症和氧化应激的调节,从而发挥对斑马鱼的抗缺氧作用。