伪狂犬病毒UL31蛋白单克隆抗体制备

作     者：王鲁方 

作者单位：河南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘忠虎

授予年度：2023年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：伪狂犬病毒 UL31蛋白 单克隆抗体 单克隆抗体鉴定 

摘      要：猪伪狂犬病毒病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的猪急性传染病;PRV对各个年龄阶段的猪均可感染,发病猪的主要表现有发热、厌食、呼吸道症状、皮肤奇痒、妊娠母猪繁殖障和仔猪角弓反张等现象。并且PRV感染宿主范围广泛,例如牛、羊、野猪、狐狸、浣熊、犬类、家兔、啮齿动物等,并且有报道发现人感染PRV的病例,PRV具有跨物种传播并感染人类的风险,我国已将伪狂犬病列为二类动物疫病,因此PRV致病机制还有待进一步深入研究。在伪狂犬病毒研究过程中发现UL31蛋白与UL34蛋白互作形成复合物定位于细胞核核膜,对PRV完成复制后出核起重要的作用;但目前为止U31蛋白在其中的作用机制尚未完全明确,因此展开了UL31蛋白单克隆抗体的研究,为UL31蛋白的研究奠定基础。为了制备PRV UL31蛋白的单克隆抗体,本研究首先利用原核表达系统制备了His-UL31重组蛋白,将纯化的His-UL31重组蛋白进行Western blot鉴定,His-UL31重组蛋白均能与His单克隆抗体特异性结合。用His-UL31蛋白作为包被抗原,包被浓度为8μg/m L,PRV感染的猪血清稀释度达到1:25 600仍可检测,建立了可特异性检测UL31抗体的间接ELISA方法。将His-UL31作为抗原来免疫12周龄雌性BALB/c小鼠,经3次免疫后取小鼠脾脏分离脾细胞并与SP2/0细胞进行融合。经4次间接ELISA方法筛选后,获得1株能稳定分泌抗UL31蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为UL31 5-11。对SP2/0细胞的染色体数目和UL31 5-11单克隆细胞进行计数,SP2/0细胞的染色体数目平均约为65条,UL315-11单克隆细胞染色体数目平均约为110条,是两亲本染色体数目之和。取杂交瘤细胞上清进行单克隆抗体亚型鉴定,确定该抗体亚型为Ig M。将单克隆细胞以每只小鼠5×10个的数量进行腹腔注射,最终获得大批量带有UL31 5-11抗体的腹水,利用辛酸-低温乙醇沉淀法获得纯化腹水,得到MAb 5-11,最后通过间接ELISA方法检测单克隆抗体效价为1:5120。通过间接免疫荧光试验、蛋白印迹分析和免疫组化试验验证MAb 5-11具有良好的特异性和反应原性。本研究成功制备了PRV UL31的单克隆抗体,为进一步研究UL31蛋白的功能与结构奠定了基础。