抗菌肽PMAP-36联合四环素对猪源肠外致病性大肠杆菌的体内外抗菌活性研究

作     者：陶旗 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：方仁东;彭练慈;曾政

授予年度：2023年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：猪源肠外致病性大肠杆菌 抗菌肽 PMAP-36 协同作用 

摘      要：肠外致病性大肠杆菌(extraintestinal pathogenic Escherichia coli,ExPEC)是一种重要的人畜共患病原体,可广泛感染哺乳动物和禽类。近年来,ExPEC在我国猪场中的分离率大幅增高,分离株大多为耐药菌株,这给传统治疗方法带来巨大挑战,因此迫切需要寻求新的治疗策略。抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是一类广泛存在于自然界的小分子多肽,在抵抗微生物感染方面发挥重要作用,且不易诱导耐药性的产生。PMAP-36属于猪源抗菌肽Cathelicidin家族中一员,具有广谱抗菌活性和免疫调节活性。AMPs与传统抗生素联合使用作为一种新的治疗方法,有望在提高抗菌效果的同时减少抗生素使用量,但PMAP-36能否联合抗生素抗猪源ExPEC感染,目前尚不清楚。本研究通过体内外试验评估PMAP-36联合四环素对猪源ExPEC的抗菌活性。1.抗菌肽与传统抗生素对猪源ExPEC体外协同抗菌效果探究通过微量肉汤稀释法检测鸡源抗菌肽CATH-1、CATH-2、CATH-3、CATH-B1,鼠源抗菌肽CRAMP,猪源抗菌肽PMAP-36、PR-39共7种AMPs对猪源ExPEC菌株PCN033和新生儿脑膜炎ExPEC菌株RS218的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌浓度(minimal bactericide concentration,MBC)。结果显示,两种猪源AMPs的杀菌能力最强,PMAP-36和PR-39对PCN033的MBC为10μM,对RS218的MBC为5μM。进一步用棋盘法检测PMAP-36或PR-39分别与四环素、庆大霉素对PCN033和RS218的联合杀菌浓度指数(fractional bactericide concentration index,FBCI)。发现PMAP-36与四环素、庆大霉素对多重耐药菌株PCN033表现出体外协同杀菌作用,PMAP-36使用浓度降低4倍,四环素使用浓度降低16倍,庆大霉素使用浓度降低8倍,FBCI分别为0.3125、0.375。2.PMAP-36联合四环素对猪源ExPEC体外抗菌作用的研究进一步研究PMAP-36与四环素、庆大霉素联合使用的协同杀菌效果。时间-杀菌曲线结果表明,亚MBC的四环素和庆大霉素不能将PCN033杀死,而与PMAP-36联合使用,PCN033在20 min内完全被消除。通过扫描电镜观察细菌形态,发现与单独用药处理PCN033相比,PMAP-36与四环素联合处理可显著破坏细菌形态。此外,四环素和PMAP-36联合使用表现出较低的细胞毒性和溶血活性。PCN033在四环素和PMAP-36单独或联合使用条件下连续传30代,结果显示,单独使用四环素导致PCN033对四环素的耐药性增加了3倍,而联合使用则未改变其对四环素的耐药性。值得注意的是,PMAP-36可以降低PCN033侵袭和黏附腹腔巨噬细胞的能力,而与四环素联用对这一作用未表现出协同效应。以上体外试验结果表明,相较于PMAP-36和四环素单独使用,药物联用能够增强对猪源ExPEC的杀菌作用,降低PMAP-36的溶血活性和对哺乳动物细胞的细胞毒性,同时PMAP-36与四环素联用可以减缓PCN033产生四环素耐药性。3.PMAP-36联合四环素对猪源ExPEC致小鼠体内感染的疗效研究为全面研究PMAP-36联合四环素对猪源ExPEC的抗菌活性,用1×10 CFU猪源ExPEC菌株PCN033腹腔感染C57BL/6野生型小鼠,建立小鼠腹腔感染模型,体内评估PMAP-36联合四环素对猪源ExPEC感染的疗效。记录单独用药治疗和联合用药治疗后小鼠的生存情况;比较各治疗组小鼠肝脏、脾脏、肺脏、血液和腹腔灌洗液(peritoneal lavage fluid,PLF)中的细菌定殖量差异;HE染色观察肺脏、脾脏组织病理变化;用ELISA检测组织器官和PLF中炎症因子水平;通过Western blot检测肺脏中紧密连接蛋白Occludin的表达水平;采用流式细胞术检测小鼠PLF中免疫细胞的募集情况,并用ELISA检测趋化因子分泌表达水平。结果显示:感染猪源ExPEC后,PMAP-36与四环素联合治疗可以显著提高小鼠的存活率(60%,6/10),单独使用四环素或PMAP-36治疗的存活率分别为0%(10/10)、20%(2/10)。与单独用药治疗组相比,联合用药治疗组中各脏器、血液和PLF细菌定殖量显著降低。联合用药可显著减轻小鼠肺部炎性细胞浸润、肺泡壁增厚和脾脏炎性细胞浸润、脾小节萎缩、细胞坏死等症状。同时,联合用药组小鼠肝脏、脾脏、肺脏和PLF中的炎症因子(IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α)与单独用药组相比均有不同程度的下降。各治疗组小鼠肺部紧密连接蛋白Occludin的蛋白表达水平无显著差异。联合用药组小鼠PLF中免疫细胞募集数量显著高于单独用药组,但趋化因子CXCL1、CXCL2的表达水平并没有差异。以上结果说明,PMAP-36和四环素联用可以保护小鼠免于全身感染猪源ExPEC,具有良好的协同治疗效果,为这两种药物在临床上联合应用提供了一定的试验依据。