污水厂中多重耐药菌的筛选鉴定及耐药机制研究

作     者：黄涵 

作者单位：哈尔滨师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王继华

授予年度：2023年

学科分类：083002[工学-环境工程] 0830[工学-环境科学与工程（可授工学、理学、农学学位）] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 0713[理学-生态学] 

主      题：污水厂 多重耐药菌 耐药机制 外排泵 耐药基因 

摘      要：耐药基因作为一种新污染物,会对人类健康产生一定的危害。目前,在各种环境中都检测到耐药基因,已经成为人类社会所面临的重大健康安全问题。探究细菌耐药性的产生及耐药机制,对于寻找安全高效的应对措施并用于指导临床用药十分重要。本研究从哈尔滨某污水厂中筛选出多重耐药细菌,解析了该场地多重耐药大肠杆菌的耐药性产生原因,为多重耐药菌药物研发提供理论基础,对多重耐药菌的监控及其防治具有重要的理论与实践意义。(1)通过对采样地进水口和出水口的环境理化特性分析,结果表明,该污水处理工艺对化学需氧量(COD)、生物需氧量(BOD)、氨氮(NH-N)、总磷(TP)、总氮(TN)均有明显的去除作用,NH-N的去除率最高,达99%。污水样品中的优势菌门为Bacteroidota(拟杆菌门)、Proteobacter(变形菌门)、Campilobacterota(弯曲杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)。经FAPROTAX分析,发现光异养、光营养、好氧化能异养、硝酸盐还原等基因功能对污水处理具有重要作用。(2)通过单加抗生素筛选实验,从中共筛选出35株耐药菌,进一步筛选得到30株多重耐药菌。选取对所用6种抗生素全部具有抗性的16株菌株进行16S r RNA分子鉴定。结果表明,16株多重耐药菌包括1株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),1株蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus),1株反硝化短枝单胞菌(Brachymonas denitrificans),1株阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii),2株肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae),2株粪产碱菌(Alcaligenes faecalis),3株奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)和5株大肠杆菌(Escherichia coli,编号为C2、E1、N2、T1、X1)。通过多位点序列分型(MLST)分析,C2的ST型为ST1589,E1为ST617,T1为ST206,N2为ST10,X1为ST1286。结果显示,N2与X1亲缘性较近,C2与T1亲缘性较近,E1与以上4株菌无近缘关系。(3)通过最小抑菌浓度(MIC)检测实验,X1对全部抗生素均表现出耐药性,且MIC较高;N2和E1对8种抗生素具有耐药性;而C2和T1对7种抗生素具有耐药性;5株大肠杆菌对四环素和红霉素均表现出了较高的耐药性。在加入羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)后5株菌分别对2～4种抗生素的MIC降低了4～16倍;加入利血平后5株菌仅对1～2种抗生素的MIC降低了4～8倍;加入N-甲基吡咯烷酮(NMP)后N2、C2、T1分别仅对一种抗生素的MIC降低了4倍以上;而X1和E1分别对三种抗生素的MIC降低了4倍以上。其中E1、C2、T1均无生物被膜形成能力,N2、X1生物被膜形成能力较弱。(4)对菌株的外排泵相关耐药基因的检测发现,tet A基因在N2、X1、E1中扩增成功;tet B基因仅有T1扩增成功;5株菌株中acr A、acr B、omp C、omp F、tol C基因均扩增成功,均未检测到Oqx AB、Qep A、emr B、emr D基因。5株菌株耐药机制均由外排系统介导,N2、X1、E1、C2耐药性与外排泵Acr AB-TolC有关,T1的耐药性与外排泵AcrAB-TolC无关。