长链非编码RNA NR＿045147对人牙周膜干细胞功能的影响及机制研究

作     者：龙璐珏 

作者单位：中南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘欧胜

授予年度：2022年

学科分类：1003[医学-口腔医学] 100302[医学-口腔临床医学] 10[医学] 

主      题：牙周膜干细胞 长链非编码RNA NR＿045147 整合素β3结合蛋白 肿瘤坏死因子-α 成骨分化 

摘      要：目的近些年来,大部分成年正畸的患者伴有不同程度的牙周炎症。一方面,牙周炎引发的牙槽骨垂直或水平吸收可以导致牙齿松动、脱落、移位,严重者可以影响患者软组织侧貌;另一方面,牙周炎患者牙齿安全移动范围受限、正畸矫治力的控制更难。因此,在展开正畸治疗之前,患者的牙周健康状况是医生必须检查的项目之一,良好的牙周健康状况是保证正畸治疗效果的前提。目前治疗牙周炎的临床常用方法均不能完全有效的再生牙周组织。人牙周膜干细胞(Human Periodontal Stem Cells,hPDLSCs)是一种牙源性间充质干细胞,具有多向分化潜能,是修复牙周受损组织的种子细胞。长链非编码RNA(LncRNA),作为一种关键调控基因,可以对编码RNA的转录及翻译产生重要影响。课题组的前期基因芯片分析发现,LncRNA NR＿045147的表达在骨髓间充质干细胞成骨诱导7天后表达明显降低。但是LncRNA NR＿045147在牙周膜干细胞及牙周组织再生中的作用尚不明确。本课题通过初步研究LncRNA NR＿045147影响牙周膜干细胞功能的生物学效应及分子机制,为今后促进干细胞基因治疗正畸患者的牙周炎症提供理论依据。方法本研究利用酶消化法体外分离、培养hPDLSCs。通过慢病毒质粒建立稳定转染细胞系。随后,通过碱性磷酸酶活性实验、茜素红染色及蛋白印迹实验检测对成骨分化的影响;细胞划痕及细胞Transwell实验检测对迁移趋化的影响;Seahorse XFe24实验检测对线粒体代谢的影响。加入10ng/ml TNF-α模拟体外炎性环境刺激hPDLSCs,并利用RT-q PCR技术检测hPDLSCs中LncRNA NR＿045147的表达情况。最后利用相关通路抑制剂及RNA pull-down实验探讨LncRNA NR＿045147影响hPDLSCs分化功能的机制。结果1.hPDLSCs稳定转染Consh与NR＿045147sh慢病毒后,敲低效率达70%。与Consh相比,NR＿045147sh细胞的成骨分化、迁移趋化及线粒体代谢能力增强。hPDLSCs稳定转染Vector与NR＿045147慢病毒后,与Vector组相比,NR＿045147过表达细胞的成骨分化、迁移趋化及线粒体代谢能力降低。2.模拟体外炎症环境0、2、4、8h后,hPDLSCs中NR＿045147基因的表达伴随IL-6、IL-8基因表达量升高而增加。同时在模拟体外炎症环境下,与Consh组相比,NR＿045147sh细胞的成骨分化、迁移趋化及线粒体代谢能力增强。3.RNA-pulldown探针检测LncRNA NR＿045147与ITGB3BP蛋白结合,与Consh组相比,NR＿045147sh细胞中LncRNA NR＿045147与ITGB3BP蛋白结合减少;同时,与Vector组相比,NR＿045147细胞中LncRNA NR＿045147与ITGB3BP蛋白结合增多。4.hPDLSCs稳定转染Vector与m RNA NM＿014288慢病毒后,ITGB3BP表达明显增多。与Vector组相比,m RNA NM＿014288细胞的成骨分化、迁移趋化能力增强。结论1.LncRNA NR＿045147抑制牙周膜干细胞成骨分化、迁移趋化及线粒体代谢的能力。2.炎症微环境可以影响牙周膜干细胞中LncRNA NR＿045147的表达。3.LncRNA NR＿045147可以调控hPDLSCs中ITGB3BP的表达。4.ITGB3BP可以促进牙周膜干细胞成骨分化及迁移趋化。